Entre estas técnicas se incluye algunos métodos aplicables a la determinación de la calidad de los ingredientes y los productos terminados, con base en su contenido de micronutrientes, tales como fibra digerible, minerales, vitaminas, actividad enzimática, etc.; así mismo, se presenta el método más ampliamente utilizado para la cuantificación de óxido de cromo durante la evaluación de la digestibilidad de las dietas.
Este método permite tener una aproximación del grado de digestibilidad de las fibras en el alimento. La muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio en ácido sulfúrico y el residuo es considerado como la fibra no digerible.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Muela la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1 mm.
Tome una submuestra y séquela durante la noche en un horno a 105°C.
Enfríe la muestra en un desecador.
Pese con aproximación de miligramos un gramo de la muestra seca y colóquela en un matraz erlenmayer de 500 ml.
Adicione 100 ml de la solución de detergente ácido y 2 ml del antiespumante.
Coloque el matraz en la mantilla con el condensador instalado.
Lleve rápidamente a ebullición (3 a 5 minutos) y continúe el calentamiento por 2 horas.
Filtre el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente pesado.
Enjuague el matraz con agua destilada caliente y filtre.
Enjuague el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente. Use succión débil (por vacío).
Enjuague el residuo con acetona y seque.
Coloque el crisol en el horno a 105°C durante 12 horas.
Enfríe dentro de un desecador la muestra e inmediatamente después determine el peso.
Cálculos
Contenido de Fibra (%) = 100 (W2/W1)
Donde
W1 = Peso de muestra (g).
W2 = Peso del residuo (g).
FIGURA 7
Determinación del contenido de fibra por el método de detergente ácido.
Este método es útil para la determinación de fibras vegetales en alimentos. Aparentemente tiene la capacidad de separar los componentes nutricionales solubles de aquellos que no son totalmente aprovechables o que dependen de la fermentación biológica para su aprovechamiento. El método tiene limitaciones en su precisión cuando los valores de proteína son muy altos y los valores de fibra son bajos.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1 mm y deposítela en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo.
Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de amilasa por muestra.
Caliente para que la solución hierva en 5 a 10 minutos; en el momento de iniciar la ebullición reduzca la temperatura para evitar la formación de espuma. Ajuste la temperatura para que la solución hierva suavemente y mantenga en reflujo por 60 minutos a partir del instante en que empieza a hervir.
Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol previamente pesado y preparado para succión al vacío. Use poco vacío al principio incrementándolo a medida que lo vaya requiriendo. Pase toda la muestra al crisol utilizando un mínimo de agua caliente (80°C) para el lavado del matraz. Elimine el vacío, afloje con cuidado la capa de muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregue agua caliente, repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con acetona sin remover la muestra del filtro y seque con vacío.
Seque los crisoles a 105°C durante 12 h y péselos en caliente (esta operación no debe durar más de 30 seg). Si no se puede pesar de inmediato, enfríe los crisoles en un desecador que contenga como desecante pentóxido de fósforo (P2O5).
El residuo de fibra recuperado se registra en términos de paredes celulares.
Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100.
NOTA:
En el caso de granos y subproductos de molinos es posible que se forme un material gelatinoso derivado de los almidones y la proteína, el cual obstruye el filtro e impide el lavado. Para mejorar la filtración haga pasar aire en sentido inverso en el crisol. Así mismo al evite que la muestra se adhiera al fondo del matraz durante el inicio del calentamiento hasta la ebullición, calentando rápidamente con agitación constante.
Cálculos
Paredes celulares (%) en “base seca” o “como se ofrece”. 100(((peso del crisol + paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra.
El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes celulares.
% contenido celular = 100 - % paredes celulares.
Van Soest, P.J. and R.H. Wine, 1967, J. Assoc. Official Anal. Chem., 50:50.
FIGURA 8
Determinación del contendido de fibra por el método de detergente neutro
Este método determina el contenido de substancias minerales insolubles en ácido clorhídrico contenidos en los alimentos; de acuerdo con el contenido mineral de la muestra se aplica ya sea el método A, para alimentos con alto contenido de materia orgánica, o el método B, recomendable para alimentos con un alto contenido de minerales, incluyéndose aquellos cuyo contenido de ceniza insoluble es mayor a 1 % al evaluarse previamente con el método A.
Reactivos
Materiales y Equipo
Método A
Calcine la muestra siguiendo el método de determinación de ceniza. Transfiera el residuo a un vaso de precipitado de 250 – 400 ml usando 75 ml de ácido clorhídrico 3N y evapore a sequedad, continúe calentando durante una hora más para deshidratar cualquier sílice presente. Enfríe y agregue 75 ml de solución de HCI 3N y caliente a ebullición suavemente por 15 minutos. Filtre la solución en caliente a través de un papel filtro libre de ceniza y lave el residuo con agua caliente hasta que el filtrado deje de ser ácido.
Seque el papel filtro conteniendo el residuo y calcine a 550–700°C en un crisol de platino prepesado, enfríe en un desecador y posteriormente pese.
FIGURA 9
Determinación de ceniza insoluble en ácido clorhídrico. Método A.
Método B
Pese alrededor de 5 g de muestra con una aproximación de 0.001 g y transfiérala a un vaso de precipitado de 250 – 400 ml. Adicione 25 ml de agua destilada y 25 ml de solución de ácido clorhídrico 3N. Mezcle con cuidado y espere hasta que ya no se liberen gases.
Agregue otros 50 ml de ácido clorhídrico y espere hasta que cese la liberación de gases y coloque el vaso en un baño maría a ebullición durante 30 minutos, con el fin de hidrolizar los almidones presentes. Filtre la solución cuando todavía este caliente con papel filtro libre de cenizas, posteriormente lave el filtro con 50 ml de agua tibia hasta que el filtrado deje de ser ácido (ver nota). Coloque el papel filtro conteniendo el residuo en un crisol de platino previamente pesado, seque y calcine la muestra a 550 – 700°C. Transfiera las cenizas a un vaso de precipitado usando 75 ml de ácido clorhídrico 3N y continúe el análisis como en el método anterior a partir de la etapa en la que se calienta la muestra suavemente por 15 minutos.
NOTA:
Si se hace difícil filtrar, repita el análisis reemplazando los 50 ml de ácido clorhídrico 3N con 50 ml de la solución A de ácido tricloroacético y enjuague el filtro con una solución tibia de la solución B de ácido tricloroacético.
Cálculos
Calcule el peso de residuo y exprese el resultado como porciento (%) de la muestra.
FIGURA 10
Determinación de ceniza insoluble en ácido clorhídrico. Método B.
Este método determina la cantidad de carbohidratos totales, basándose en su contenido de almidones hidrolizables y azúcares solubles.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Extracción:
Pese con aproximación de 0.001g 1.0g de muestra seca ó 2.5g de muestra húmeda conteniendo aproximadamente de 60 a 300 mg de carbohidratos totales disponibles.
Transfiera cuantitativamente a una probeta graduada de 100 ml con tapón.
Adicione 10 ml de agua y agite con una varilla de vidrio para dispersar la muestra.
Adicione 13 ml de la solución de ácido perclórico. Agite constantemente con la varilla de vidrio durante 20 minutos.
Enjuague la varilla con agua destilada y lleve el volumen a 100 ml. Mezcle y filtre a un matraz volumétrico de 250 ml.
Enjuague la probeta graduada con agua destilada y adicione al matraz volumétrico. Afore el matraz con agua destilada y agite.
Determinación:
Diluya 10 ml del extracto a 100 ml con agua destilada. Con una pipeta pase a un tubo de ensaye 1 ml del filtrado diluido.
Tome con la pipeta dos muestras de 1 ml de agua destilada que servirán como blancos por duplicado y coloque cada uno de ellos en un tubo de ensaye.
Tome dos blancos duplicados de 1 ml usando la solución de glucosa diluida.
Agregue rápidamente a todos los tubos 5ml de reactivo de anthrone recién preparado. Tape los tubos y mezcle vigorosamente. Colóquelos en un baño maría y caliente durante 12 minutos.
Enfríe rápidamente a temperatura ambiente. Transfiera la solución a celdas para espectrofotómetro de 1 cm. El color verde es estable sólo por 2 horas.
Lea la absorvancia a 630 nm contra el blanco.
Cálculos
Carbohidratos totales disponibles (% de glucosa) = (25 × b)/(a × W)
Donde
W = Peso en g de la muestra.
a = Absorvancia del estándar diluido1.
b = Absorvancia de la muestra diluida.
Clegg, K.M. (1956). J.Sci. Food Agric. 7, 40.
FIGURA 11
Determinación de carbohidratos totales disponibles en alimentos.
Esta técnica permite reconocer la porción de nitrógeno de origen proteico y no proteico de los materiales analizados. Puede aplicarse a todo tipo de materiales.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Pese 2 g de muestra con más de 25% de proteína cruda, lg para rangos de 25 – 50% de proteína y 0.5g para materiales con más de 50% de proteína cruda. Transfierala a un matraz kjeldahl y agregue aproximadamente 50 ml de agua destilada, unos pocos gránulos de antiebullente y una o dos gotas del antiespumante.
Caliente a ebullición durante 30 minutos (teniendo cuidado de que no se seque). Cuando la muestra esté todavía caliente agregue 2 ml de la solución de sulfato de aluminio y potasio, mezcle perfectamente y caliente a ebullición, adicione 50 ml de la solución de acetato de cobre mezclando perfectamente bien y deje enfriar. Filtre usando vacío. Lave el matraz y el precipitado con 50 ml de agua destilada fría.
Para evaluar el nitrógeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de nitrógeno total de kjeldahl. El nitrógeno no proteico se analiza por medio de la misma técnica a partir del líquido filtrado. Los resultados respectivos de los sólidos y líquidos por medio de kjeldahl ofrecerán directamente los datos de nitrógeno proteico (NP) y no proteico (NNP) respectivamente.
FIGURA 12
Determinación del contenido de nitrógeno proteico y no proteico en alimentos.
El método más preciso para la determinación de concentraciones proteicas es probablemente el método de hidrólisis ácida. La mayor parte de los otros métodos son sensibles a la composición de aminoácidos de las proteínas y no pueden ser obtenidas concentraciones absolutas. El procedimiento de Lowry no es la excepción, pero es sensiblemente constante de proteína a proteína, lo cual ha hecho que sea ampliamente usado y que las determinaciones sean una alternativa completamente aceptable con un rigor absoluto en todas las determinaciones en casi todas las circunstancias en donde se involucren mezclas de proteínas o extractos crudos.
Reactivos
| Solución madre (μl) | 0 | 1.25 | 2.50 | 6.25 | 12.50 | 25.00 | 62.50 | 125.0 | 250.0 |
| Agua (μl) | 500 | 499 | 498 | 494 | 488 | 475 | 438 | 475 | 250 |
| Concentración de proteína (μg/ml) | 0 | 10 | 20 | 50 | 100 | 200 | 500 | 1000 | 2000 |
Procedimiento
A 0.1 ml de muestra o sol. estándar, adiciónele 0.1 ml de sol. NaOH 2N. Caliente a 100°C durante 10 min a baño maría hirviendo para hidrolizar la muestra.
Deje enfriar a temperatura ambiente y agréguele 1 ml del reactivo de formación de complejo recién preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min.
Adicione 0.1 ml de reactivo de Folín, agite con un mezclador de vórtice y deje reposar a temperatura ambiente durante 30–60 min (no exceda este tiempo).
Lea la absorvancia a 750 nm si la concentración de la proteína fuera menor a 500 μg/ml, ó 550 nm si fuese entre 100 y 2000 μg/ml.
Trace una curva estándar de absorvancia como función de concentración inicial de proteína y úsela para determinar el contenido de proteína en la muestra.
NOTA
Si la muestra se encuentra como precipitado, disuélvalo en NaOH 2N e hidrolice como en el paso 1. Use alícuotas de 0.2 ml del hidrolizado para el paso 2.
Todas las células u otras muestras complejas pueden requerir un pretratamiento como el descrito por Burton (1984) para DNA.
Mezcle rápidamente en cuanto el reactivo de Folín sea adicionado; esto es importante para obtener una adecuada reproductibilidad.
Se requiere un grupo de estándares para cada ensayo, preferentemente por triplicado o duplicado.
FIGURA 13
Determinación de proteína en alimentos por el método de Lowry
Este método permite cuantificar el contenido de urea en ingredientes alimenticios.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Pese aproximadamente 2 g de muestra con una precisión de 0.001 g, o una cantidad que se espera contenga de 50 a 200 mg de urea y colóquela en un matraz volumétrico de 500 ml. Agregue 150 ml de ácido clorhídrico 0.02N, agite por 30 min y adicione 10 ml de la solución de acetato de sodio y mezcle. Agregue 1 g de carbón activado, agite perfectamente bien y deje reposar la mezcla por 15 min. Adicione 5 ml de la solución Carrez I, seguido por 5 ml de la solución Carrez II, mezclando perfectamente bien entre las adiciones. Afore con agua destilada y mezcle bien. Filtre una parte con un papel filtro seco en un vaso de precipitado de 250 ml limpio y seco.
Determinación
Transfiera 10 ml del filtrado a un tubo de ensaye con tapón esmerilado, adicione 10 ml de la solución 4-DMAB, mezcle y deje reposar por 15 min. Mida la absorvancia de la solución a 435 nm en una celda de 10 mm, contra una solución de referencia preparada con los reactivos.
Curva de Calibración
Diluya 5, 10, 20, 30 y 40 ml de solución de urea a 100 ml de agua. Transfiera 10 ml de cada solución a tubos de ensaye con tapón esmerilado y adicione 10 ml de la solución 4-DMAB a cada uno. Mezcle y deje reposar por 15 minutos, mida la absorvancia como se señaló anteriormente contra una solución de referencia preparada con 10 ml de solución 4-DMAB y 10 ml de agua, haga una gráfica relacionando las absorvancias con la cantidad de urea presente.
Expresión de Resultados
Determine la cantidad de urea en la muestra por referencia con la curva de calibración elaborada. Exprese los resultados como por ciento de la muestra.
% Urea × 0.4665 = % N urea.
NOTA:
Si la muestra está muy coloreada, la cantidad de carbón activado deberá ser incrementada arriba de 5 g. La solución final después del filtrado deberá ser incolora.
FIGURA 14
Determinación del contenido de urea en ingredientes alimenticios.
A través de este método es posible determinar el contenido de ácido úrico y sus sales tanto en gallinaza como en alimentos e ingredientes que los constituyen.
Reactivos
Verifique la concentración de la solución disponible, para lo cual mezcle 30 ml de ésta con 50ml de solución de NaOH IN y 25ml de solución de Peróxido de hidrógeno (20 volúmenes). Caliente en baño de vapor hasta que no haya más efervescencia. Enfríe y titule con NaCl IN usando indicador de fenoftaleína. Realice una titulación de blanco usando 3 ml de agua en lugar del formaldehído y calcule la concentración como sigue:
1ml de la solución de NaOH IN = 0.0300 g de formaldehído.
Conc. de formaldehído (g/100 ml) = ((B-T) × ((0.0300 × 100)/3)
Donde
B = Titulación del blanco.
T = Titulación de la muestra.
Prepare una solución neutra que contenga 17.5g de formaldehído con 250ml de agua y 500ml de etanol. Ajuste el pH a 7.0 con una solución de NaOH 0.1N. Diluya a 1000ml con agua, mezcle y ajuste nuevamente el pH de ser necesario.
Materiales y Equipo
Extracción del ácido úrico:
De la gallinaza: Pese con una aproximación de 0.001 g cerca de 0.4g de gallinaza seca y colóquela en un matraz de fondo redondo de 150ml. Adicione 60ml de solución neutra de formaldehído, conecte a un condensador de reflujo y caliente en baño de vapor por una hora. Enfríe y filtre a través de un crisol (Porosidad 4) a un matraz volumétrico de 100ml. Enjuague el matraz 3 veces consecutivas con porciones de 10ml de solución de formaldehído etílico, pasando cada porción por el crisol de filtración al matraz volumétrico. Afore con la misma solución y agite.
De los alimentos: Pese 4 a 5g de muestra con una aproximación de 0.001 g y desengrasela por extracción con éter de petróleo. Transfiera cuantitativamente la muestra desengrasada a un matraz de fondo redondo y remueva el solvente residual con una corriente suave de aire. Continúe el análisis como previamente se señaló, iniciando con la adición de 60 ml de solución de formaldehído etílico.
Determinación
Transfiera con una pipeta de 20 ml de extracto de la muestra prepesado, según los métodos descritos, a un tubo de centrífuga de 50 ml. Adicione 10 ml del reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y déjelos reposar en la oscuridad por una hora. Centrifuge a 2000 rpm por 15 min. Retire el sobrenadante y deje escurrir por 10 min. Cuidadosamente limpie cualquier líquido remanente sin perturbar el precipitado y adicione 20 ml de solución de tiosulfato de sodio. Disuelva el precipitado, agitando con una varilla de vidrio delgada. Con una pipeta transfiera 5 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 200 ml conteniendo 40 ml de solución buffer de succinato, afore con agua destilada y mezcle bien. Mida la absorvancia de la solución a 294 nm en celdas de sílice de 10 mm comparada contra una solución preparada mezclando 5 ml de solución de tiosulfato de sodio con 40 ml de solución buffer de succinato aforada a 200 ml con agua destilada. Determine la cantidad de ácido úrico mediante una curva de calibración.
Curva de Calibración:
En una serie de tubos de centrífuga de 50 ml de capacidad transfiera con una pipeta 2, 4, 6, 8, 10 y 12 ml de solución estándar de ácido úrico (equivalentes a una cantidad similar de ácido úrico en mg) y llévelos a 20 ml con la solución de formaldehído etílico. Adicione a cada tubo 10 ml de reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y déjelo reposar en la oscuridad por una hora. Continúe el método como en la determinación a partir del centrifugado. Mida la absorvancia de la solución y trace la curva de calibración graficando absorvancia (y) contra la cantidad correspondiente de ácido úrico en mg (x).
Expresión de Resultados
El contenido de N del ácido úrico como % de la muestra está dado por la fórmula:
% N = A/(6 × W)
Donde
A = mg de ácido úrico (en la alicuota del extracto de la muestra) determinado
por la medición fotométrica.
W = peso de la muestra en g.
FIGURA 15
Determinación de ácido úrico en gallinaza e ingredientes alimenticios
Este método proporciona una estimación de la disponibilidad de minerales en base a su digestibilidad en ácido.
Reactivos, Materiales y Equipo
Procedimiento
Use el residuo obtenido de la determinación de ceniza. Caliente 25 ml de ácido clorhídrico con cuidado para evitar salpicar y filtre en el papel y enjuague con agua caliente hasta que quede libre del ácido. Coloque el papel filtro y el residuo en un crisol de porcelana prepesado seco y colóquelo en la mufla a 600 °C durante 2 horas o hasta que quede libre de carbón.
Cálculos
Ceniza insoluble (%) = 100(Peso de la ceniza tratada con ácido/Peso de la muestra)
FIGURA 16
Determinación de ceniza soluble e insoluble en ácido clorhídrico
La evaluación de calcio en la dieta reviste una gran importancia ya que un desbalance con el fósforo u otros minerales generará un bajo crecimiento.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Calcine en crisol de porcelana 2.5g de muestra finamente molida. Adicione 40ml de HCI y unas gotas de HNO3 al residuo, caliente el crisol hasta ebullición, enfríe y transfiera a un matraz volumétrico de 250ml, afore y mezcle. Pase a un vaso de precipitado 100ml de sol. para cereales o alimentos con cereales ó 25ml para alimentos con minerales. Diluya a 100ml y adicione 2 gotas de rojo de metilo. Adicione NH4OH gota a gota hasta que vire a pardo anaranjado, luego adicione 2 gotas de HCl para dar un color rosa. Diluya con 50ml de agua, hierva y adicione con agitación 10ml de sol 4.2% de oxalato de amonio. Ajuste el pH con ácido para regresar al color rosa si es necesario.
Déje reposar, filtre y lave el precipitado con la solución de NH4OH (1.5%). Coloque el papel filtro con el precipitado en un vaso, adicione una mezcla de 125ml de agua y 5ml de H2SO4, caliente a 70°C y titule con la solución de permanganato y calcule:
Ca (%)= 0.1((ml Sol. Permanganato/Peso de la Muestra) × (Alicuota usada en ml/250)
FIGURA 17
Determinación de calcio en alimento e ingredientes alimenticios.
Al igual que el calcio, este mineral es indispensable para el buen desarrollo de los organismos cultivados, debiendo estar presente en las dietas en cantidades suficientes para satisfacer las necesidades metabólicas de los organismos. Este elemento en proteínas de origen vegetal puede estar formando parte de fitatos, por lo cual su disponibilidad puede estar limitada, por lo que se recomienda una determinación de ácido fítico previa al uso de tales materiales.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Pase una alicuota como en la determinación de Ca a un matraz de 100 ml y adicione 20 ml del reactivo de molibdovanato. Aforelo, mezcle y deje reposar por 10 min.
Transfiera alicuotas del estándar de trabajo conteniendo 0.5, 0.8, 1.0 y 1.5 mg de P en matraces de 100 ml y trátelos como al anterior.
Lea la muestra a 400 nm ajustando el estándar de 0.5 mg a 100% de transmisión.
Determine mg de fósforo en la muestra usando una curva estándar.
FIGURA 18
Determinación de fósoforo en dietas e ingredientes alimenticios.
Este método permite determinar la cantidad de sal presente en harina de pescado y otros ingredientes.
Reactivos
Procedimiento
Pese 2 g de muestra en un matraz erlenmayer de 250 ml, humedezca la muestra con 20 ml de agua, adicione con pipeta 15 ml de la solución de nitrato de plata y mezcle bien.
Adicione 20 ml de Acido Nítrico concentrado y 10 ml de la solución de Permanganato de Potasio y mezcle. Caliente continuamente la mezcla hasta que el líquido se aclare y desaparezca los vapores nitrosos, enfríe.
Adicione 10 ml de Solución de Urea y deje reposar por 10 min.
Adicione 10 ml de acetona y 5 ml de indicador férrico y titule el exceso de nitrato de plata con la solución de Tiocianato hasta el punto final rojo-café.
Cálculos
Calcule resultados como NaCl
%NaCI= (15.00 - ml 0.1N NH4CNS × 0.585)/g de muestra
FIGURA 19
Determinación de cloruro de sodio en harina de pescado y otros ingredientes
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Seque 2 g de muestra en un crisol de sílice a 100°C para eliminar la humedad. Adicione unas cuantas gotas de aceite de oliva y caliente sobre la flama hasta que deje de producir flama.
Calcine a 500°C en la mufla por 24 h, enfríe y adicione 2 ml de HCI concentrado para disolver el residuo.
Llévelo a 100 ml con agua destilada, tome 1 ml de la solución y haga una nueva dilución a 100 ml con agua destilada.
Ajuste el fotómetro de flama para que de una lectura de 100 con el estándar de 10 ppm y lea la solución muestra.
Si la lectura no se encuentra entre 50 y 100 haga una dilución al momento para dar una lectura apropiada.
FIGURA 20
Determinación del contenido de potasio en ingredientes alimenticios.
El óxido de cromo es el marcador más ampliamente utilizado durante la evaluación de la digestibilidad en dietas experimentales para peces. El método aquí presentado es una modificación del propuesto por Furukawa y Tsukahara, a fin de manejar micromuestras durante la determinación del contenido de óxido de cromo en dietas y heces.
Reactivos
Materiales y equipo
Procedimiento
Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habrá eliminado previamente escamas y cualquier otra materia extraña; manténgalos a sequedad. Pese con precisión de 0.0001g de 50 a 100mg de muestra, colóquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese nuevamente la charolilla para ajustar peso de la muestra. Adicione 5ml de HNO3 y ponga a digerir en ebullición suave por un mínimo de 30 min hasta que desaparezcan los vapores amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad de líquido y continúe habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de ácido nítrico y siga digiriendo. Al término la solución debe ser clara, de color verdoso y no debe desprender vapores ocres. Deje enfriar.
Ya fría la solución, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del matraz 3ml de ácido perclórico. Realizar la adición dentro de una campana de extracción y con mucho cuidado, ya que en caso de una digestión incompleta se puede presentar una reacción explosiva. Coloque nuevamente el matraz en el digestor y continúe la ebullición hasta que la solución vire de verde a amarillo limón; apague el digestor y deje enfriar. Ya frío se debe formar un anillo rojizo en el borde del líquido; en caso de no formarse o si el líquido se torna verde nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea permanente.
Pase el líquido frío a un matraz volumétrico de 25 ml, enjuagando el matraz kjeldahl varias veces con agua destilada y afore. Ajuste a O el espectrofotómetro con un blanco de reactivos y leer a 350 mm. El blanco se prepara simultáneo a la muestras usando solamente los ácidos y agua destilada.
Cálculos
a) Calcule la cantidad de óxido de cromo (mg) presente en la muestra:
X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4
Donde
Y = absorvancia
0.0032 y 0.2089 son constantes
b) Calcule el % de óxido de cromo en la muestra:
O.C.% = 100(X/A)
Donde
X = peso del óxido de cromo
A = peso de la muestra
FIGURA 21
Determinación de óxido de cromo en alimentos y heces.
El método permite determinar la cantidad de lisina libre que reacciona con el l- fluorodinitro benceno.
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Muela la muestra para que pase el tamiz de 0.5 mm. La cantidad de muestra a utilizar deberá contener alrededor de 12mg de lisina disponible, lo que equivale a 0.3 – 2g de la muestra. Pasela a un matraz de fondo redondo. Agregue 2–3 perlas de vidrio y 10ml de NaHCO3, agitar suavemente para que la muestra no se adhiera a las paredes.
Adicione 15 ml de FDNB y agite suavemente durante 2 horas. No permita que la muestra se quede en las paredes. Evapore el etanol pero no el agua; en un baño de agua hirviendo el matraz debe perder aproximadamente 12.5g.
Enfríe y adicione 30ml de HCI 8.1M para neutralizar al NaHCO3. Sumando el agua presente, se tendrá un volumen de 40ml y una concentración de ácido de 6M. Reflujar suavemente durante 16 horas.
Desconecte el matraz y lave el refrigerante con un poco de agua. Filtre en caliente a un matraz volumétrico de 250 ml. Enjuague el matraz y el filtro varias veces con agua destilada y colecte en el matraz volumétrico; afore en frío con agua destilada. En ocasiones se forma un precipitado de dinitrofenol que se puede extraer con pipeta una vez precipitado, o se elimina con el éter.
Colocar 2 ml del filtrado en dos tubos con tapón, etiquetándolos A y B. Agregar al tubo B 5 ml de éter y agita. Extraiga el éter (capa superior) con una pipeta automática. Coloque el tubo en un baño a 90°C hasta que se elimine todo el éter y enfríe.
Agregue una gota de fenoftaleína al tubo, adicione gota a gota la solución de NaOH hasta que aparezca un ligero color rosado; añada 2ml de buffer de carbonato y agregue dentro de una campana 0.5 ml de metilcloroformato. Tapar el tubo y agitar vigorosamente, liberando la presión con cuidado. Después de 5 ó 10 min, adicione gota a gota 0.75 ml de HCI concentrado agitando para evitar la formación de espuma. Se extrae cuatro veces la solución con éter como se describió anteriormente. Elimine el éter residual en baño maría, enfríe y lleve el volumen 10 ml con agua destilada.
Durante las pausas de las manipulaciones del tubo B, extraiga tres veces con éter el tubo A; elimine el éter residual y lleve a 10 ml con HCl. Lea la absorvancia de ambos tubos a 435 nm en el espectrofotómetro contra agua destilada. La lectura del tubo menos la del tubo B (blanco) es la absorvancia atribuible al DNP - lisina.
Absorvancia del estándar DPN - Lisina
Coloque 2 ml de DNP-L diluido en dos tubos A y B siguiendo el procedimiento ya indicado-Practicar hasta que se tenga confianza en las manipulaciones. La absorvancia neta se usará para calcular las muestras problema. El blanco B tiene generalmente una absorvancia de 0.01; si el valor es mucho mayor revisar el procedimiento, especialmente el frasco de servicio, el pH del buffer de carbonato, la longitud de onda a que se está leyendo y el éter libre de peróxidos.
Precauciones con alimentos de origen vegetal.
En alimentos de origen vegetal en ocasiones no se logra una hidrólisis total a las 16 horas y como un tiempo más largo se descompone el DNP-L, debe hacerse una segunda digestión con materiales desconocidos. Para lograr esto, después de la digestión se filtra, se lava y se procesa el filtrado como se señaló. El residuo se coloca en un matraz de fondo redondo con HCI 6 M y algunas perlas de vidrio (se pueden juntar los residuos de las réplicas); el volumen del ácido clorhídrico debe ser menor a 30 ml. Se deja en reflujo por 16 horas, se filtra en caliente y se lleva a 100 ml según el procedimiento ya descrito. Si el resultado es muy pequeño se elimina, o de lo contrario, se hacen las correcciones necesarias para el material.
Para determinar la pérdida de DNP-L se debe calcular un factor de corrección, el cual varía con el material. Para su cálculo, consultar a: Makade, M.L. y Liener, I.E., 1969. Anal. Biochem., 27:271.
Cálculos
C = (Ws × Au × V × 100 × 100)/Wu × As × a (cp)
Donde
C= g de lisina/16g de N
Ws= Peso del estándar expresado como mg de Lis en 2 ml; 0.1 sí se prepara como se
indica.
Wu= Peso de la muestra en mg
As= Absorción neta del estándar
Au= Absorción neta del desconocido
V= Volumen del hidrolizado filtrado. Se recomienda 250 ml (menos por la segunda
digestión).
a= Alícuota del filtrado. Se recomiendan 2 ml.
CP= Proteína cruda, 6.25 × g N/100g material.
Para expresar el resultado como g lisina/Kg de PC, cambiar un 100 por 10 en la fórmula.
NOTA:
El material de vidrio puede tomar un tinte amarillento debido al dinitrofenol. Los hidrolizados y soluciones de DNP-Lisina deben protegerse de la luz especialmente a pH alcalino.
FIGURA 22
Determinación de lisina disponible en ingredientes alimenticios.
Los peces, según su especie, presentan una capacidad diferencial para utilizar carbohidratos en su dieta, por lo cual se considera importante contar con un método rápido para la determinación de azúcares totales disponibles.
Reactivos:
Materiales y Equipo
Procedimiento
Disuelva 8g de melaza y llévela a 500ml con agua destilada (filtre). Hidrolice 100 ml del filtrado con 5ml de HCI (Sp. g 1.18) y deje reposar por 24 h. Neutralice con NaOH al 20% usando fenoftaleína como indicador y diluya a 200 ml.
Estandarización de la Solución Soxhlet: Mida 10ml de la solución Soxhlet (a) y (b) con una pipeta volumétrica y vacíe a un matraz erlenmayer, mezcle y agregue 30ml de agua. Adicione con una bureta un volumen de estándar de trabajo casi suficiente para reducir el Cobre en la solución Soxhlet. Llévelo a ebullición y déjelo hervir por 2 min., adicione 4 gotas de azul de metileno y rápidamente complete la titulación mientras está hirviendo, hasta que se obtenga un color naranja brillante. Repita varias veces y determine el volumen de solución requerido para reducir completamente 20 ml de solución Soxhlet.
Titulación de Muestra: Primero realice una titulación aproximada; pase a un matraz 10ml de las soluciones (a) y (b), adicione alícuotas de 10ml de la solución muestra. Añada 40 ml de agua y llévelo a ebullición. Si persiste el color azul, titule con una solución estándar de trabajo y calcule el contenido aproximado de azúcar en la muestra. Para determinar con precisión el contenido de azúcar, pase a un matraz 10 ml de las soluciones Soxhlet (a) y (b); adicione una alícuota de la solución muestra. El volumen de muestra usado dependerá del contenido de azúcar en la muestra. Adicione agua como se indica en la tabla, mezcle y hierva. Durante la ebullición, agregue estándar de trabajo con una bureta hasta que la titulación sea casi completa. Añada azul de metileno y complete la titulación.
| ml de H2O | ml de muestra | g de muestra en alícuota | Total como azúcar invertida (%) |
| 40 | 10 | 0.08 | 73 |
| 35 | 15 | 0.12 | 82-58 |
| 30 | 20 | 0.16 | 61-41 |
| 25 | 25 | 0.20 | 49-35 |
| 20 | 30 | 0.24 | 49-29 |
Calcule el % de azúcar (como invertida) = (F - M) × I × 100/w
Donde:
F= Volumen de estándar necesario para reducir 20 ml de Solución Soxhlet.
M= Volumen de solución estándar de azúcar requerido para completar la titulación
I= Peso de la azúcar invertida en 1 ml de Standard de trabajo.
W= Peso de la muestra en la alícuota usada.
FIGURA 23
Determinación de azúcares totales disponibles en melaza
