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CHAPITRE 8
LES TECHNIQUES DE BASE POUR L'ETUDE DE LA GLOSSINE AU LABORATOIRE

8.1 ELEVAGE DES PUPES VIVANTES

Les pupes de tsé-tsé peuvent être conservées dans un cristallisoir rempli de sable propre et sec et placé dans une cage. La cage devra se trouver dans une salle obscure dont la température ne sera jamais ni trop élevée ni trop basse. Une température de l'ordre de 22° – 25°C correspond aux conditions optimales. L'humidité relative devra être maintenu eaux alentours de 80 pour cent. Si l'on ne dispose pas d'un humidificateur convenable, on devra placer des plateaux de sable humide à proximité des pupes, en évitant le contact direct. Les pupes ne doivent pas être mouillées.

Si l'on se propose d'élever des parasites des pupes, celles-ci devront être placées individuellement dans des tubes à spécimens bouchés par un tampon de coton. Ainsi, les minuscules guêpes parasites qui pourraient éclore n'auront pas la possibilité de s'échapper alors qu'elles pourraient le faire si l'on utilisait une cage ordinaire en résille de nylon ou de térylène.

8.2 MANIPULATION, CONSERVATION ET TRANSPORT DES MOUCHES VIVANTES

8.2.1 Manipulation et alimentation. Les indications que l'on trouvera ici permettront a l'agent de terrain de maintenir en vie pendant quelques jours à quelques semaines les mouches qu'il a capturées. Il ne s'agit pas de donner absolument tous les détails de ce qu'il faut faire pour entretenir indéfiniment une colonie, car c'est la une tâche très spécialisée.

Les tsé-tsé vivantes doivent être traitées avec beaucoup de soin si l'on veut les maintenir en vie.

Elles doivent être tenues à l'écart des insecticides, de la peinture fraîche, de la fumée, des produits chimiques agressifs, de l'eau de Javel, des fumées d'essence et de gasoil ainsi que de la lumière solaire directe. Aucune personne ayant manipulé des insecticides ou portant encore les vêtements qu'elle avait sur elle lors d'un épandage d'insecticides ne doit pas s'approcher des mouches.

Si l'on peut disposer d'une pièce climatisée, les conditions optimales sont les suivantes: environ 25°C et 70–80 pour cent d'humidité.

Lorsqu'on se trouve sur le terrain, on ne peut souvent faire autre chose que de veiller a ce que les mouches n'aient ni trop chaud ni trop froid; on placera des plateaux de sable humide sous les cages pour maintenir l'humidité requise. Les cages seront placées dans un lieu ombragé, en évitant de les exposer à la fraîcheur de la nuit. Si les mouches sont capturées sur le terrain, il faudra les nourrir le jour même de leur capture, puis chacun des jours suivants.

A cette fin, on pourra utiliser comme hôte, une chèvre, un lapin ou un cobaye qui devront être traités en cas d'infection par des trypanosomes. L'animal sera attaché dans un enclos (chèvre) ou place dans une boîte (lapin ou cobaye). La cage sera posée sur le flanc de l'animal si c'est une chèvre ou un cobaye, ou sur l'oreille si c'est un lapin. L'endroit du corps en contact avec la cage devra être tondu et la peau sera lavée à l'eau et au savon.

8.2.2 Cages (Fig. 8.1). Les mouches peuvent être conservées dans des tubes individuels ou dans des cages de grandes dimensions.

Les tubes à spécimens (Fig. 8.1 A) sont utiles pour conserver les mouches individuellement. Ils sont fermés par un morceau de toile moustiquaire. On pourra en faire des paquets attaches au moyen d'un solide élastique. On peut aussi utiliser du tube plastique de grand diamètre, découpe et fermé à une extrémité par un bouchon en liège et à l'autre par un morceau de toile moustiquaire.

Il est parfois commode de placer plusieurs mouches dans une seule cage de grandes dimensions. On peut, par exemple, utiliser la cage type Roubaud ou la cage Geigy (Fig. 8.1 B). Cette dernière est faite d'un cadre parallélépipédique en fil d'acier inoxydable de 3 mm de diamètre recouvert d'une moustiquaire de térylène noir. L'une des faces est constituée d'une plaque percée d'un trou rond par lequel on peut introduire ou prélever les mouches. Le reste du temps, le trou est fermé par un bouchon de liège.

Dans la cage Roubaud, aucune des faces n'est obturée par une plaque, car la housse en tulle moustiquaire déborde de l'une des extrémités pour former un manchon qu'il suffit de nouer avec un lacet ou un élastique pour fermer la cage.

Dimensions des cages les plus couramment utilisées:

taille 25. Pour 25 femelles. 25,4 × 12,7 × 5 cm;

taille 10. Pour 10 femelles. 15    ×   8,5 × 5 cm.

Fig. 8.1

Fig. 8.1 Cages et flacon pour tuer les mouches; A, cage confectionnée avec du tube plastique de grand diamètre, Une extrémité est fermée par un bouchon tandis que l'autre est munie d'une moustiquaire. Ce dispositif permet de conserver les mouches individuellement; B, cage de Geigy; C, flacon pour tuer les mouches consistant en un tube a spécimens contenant à sa base un tampon de coton imbibé de quelques gouttes d'acétate d'éthyle et surmonte d'une couche de papier blanc propre; D, cage dont l'armature est faite de morceaux de tube plastique mis à la forme requise.

On peut fabriquer des cages meilleur marché avec des matérieaux trouvés sur place. Par exemple, on peut en découper une dans un gros tuyau de plastique dont les ouvertures sont recouvertes d'une moustiquaire en térylène (Fig. 8.1 D).

Pour retirer de la cage les mouches mortes, ou prélever des mouches vivantes, on pourra utiliser un tube à essai en verre ou un dispositif du type de ceux qui sont représentés sur la Fig. 8.2.

8.2.3 Transport. Si les mouches sont expédiées relativement loin, il faut les nourrir le matin du départ. Puis les cages seront étiquetées et soigneusement emballées en se souvenant que le paquet risque de séjourner dehors en plein soleil. Une bonne solution consiste à entourer la cage d'un rembourrage épais et à la placer dans une boîte de polystyrène. Le tout sera emballé dans du papier d'emballage. Les cages peuvent également être enveloppées dans une serpillière humide et propre.

L'avantage de la boîte en polystyrène c'est qu'elle assure une bonne isolation et qu'elle est très légère. Toutefois, on peut se contenter d'une boîte en carton si l'on bourre soigneusement l'espace entre la cage et la boîte avec un matériau propre.

Il n'est pas possible d'expédier des mouches par la poste car cela prendrait trop de temps. En revanche, on peut le faire s'il s'agit de pupes, puisque celles-ci ne s'alimentent pas.

8.3 CONSERVATION DES MOUCHES MORTES

On peut avoir à conserver des mouches ou des pupes mortes pour les raisons suivantes:

  1. si son identité est douteuse, on devra conserver le spécimen pour le montrer ultérieurement à un expert;

  2. on peut avoir besoin d'une collection de référence pour former de nouveaux agents et leur apprendre à reconnaître les espèces de glossines;

  3. on peut avoir besoin de constituer une collection aux fins de la recherche.

Fig. 8.2

Fig. 8.2 Deux types d'aspirateurs à mouches; passer l'extrémité des tubes de verre à la flamme afin d'en supprimer les aspérités tranchantes

8.3.1 Comment tuer les mouches. Si l'on veut de bons spécimens pour une collection, il vaut mieux tuer les mouches au moyen de vapeurs toxiques plutôt que de leur écraser le thorax, ce qui risque de les endommager.

On peut utiliser des vapeurs d'éther, de chloroforme ou d'acétate d'éthyle. C'est l'acétate d'éthyle qui convient le mieux; et en outre, il est moins dangereux à manipuler que les autres liquides. C'est un produit que l'on ne peut se procurer qu'auprès de laboratoires spécialisés. Il faut être prudent car c'est un produit inflammable. La figure 8.1 C montre un dispositif commode pour mettre les mouches en contact avec les vapeurs tout en les maintenant à distance du liquide. On place un morceau d'ouate ou un mouchoir en papier au fond du tube à spécimens et on l'imbibe avec quelques gouttes de liquide (de préférence de l'acétate d'éthyle). On enfonce ensuite un morceau de papier ordinaire dans le tube en veillant à ce qu'il ne vienne pas toucher l'ouate imbibée. On bouche le tube et on laisse reposer quelques minutes. Lorsqu'on introduit les mouches dans le tube, elles s'immobilisent et meurent en environ une minute.

8.3.2 Epinglage des mouches (Fig. 8.3). Pour conserver les insectes, et notamment les tsé-tsé, on a l'habitude de les épingler et de les enfermer dans une boîte étanche â l'air. On enfonce une épingle entomologique en inox à travers la face dorsale du thorax, de préférence pendant que la mouche est encore fraîche. La mouche sera placée à un peu plus de la moitié de l'épingle. Une étiquette portant les renseignements nécessaires (Fig. 8.3 F) sera placée au-dessous, puis on enfoncera bien l'épingle dans la garniture de liège de la boîte (voir 8.3.4).

Fig. 8.3
Fig. 8.3

Fig. 8.3 Epinglage et montage des mouches et des pupes destinées a une collection; A, mouche épinglée et étiquetée sans préparation; B, mouche épinglée, étalée et étiquetée; C, utilisation d'une pince entomologique pour manipuler les mouches épinglées; D, montage et étiquetage des pupes; E, préparation d'une mouche récemment tuée; F, mouche et son étiquette sur son épingle.

Ainsi conservées, les mouches peuvent déjà être très utiles, toutefois il est préférable de les étaler de façon spéciale pour bien faire apparaître l'abdomen et les tarses.

Pour donner le maximum de valeur à une collection, il faut disposer la mouche encore fraîche de manière à bien mettre en évidence les ailes, l'abdomen et les pattes (Fig. 8.3 E). Les plaques de liège peuvent être obtenues chez un fournisseur de matériel entomologique, mais on peut les remplacer par autre chose. Ailes et pattes seront étalées comme l'indique la figure, les ailes étant maintenues en place au moyen de bandes de papier épinglées a leur extrémité. Les pattes seront maintenues en place par des épingles. On laissera l'insecte sur la plaque de de liège pendant quelques jours, jusqu'à ce qu'il durcisse. La plaque devra donc être placée dans une boîte sèche, à l'abri des fourmis et autres insectes susceptibles d'endommager les spécimens. Une fois que la mouche a durci (au bout de 3 ou 4 jours), on peut enlever les papiers qui maintiennent les ailes ainsi que les épingles qui maintiennent les pattes. On ajoutera alors l'étiquette datée et l'on placera le spécimen épinglé dans sa boîte.

8.3.3 Epinglage des pupes. Il est difficile d'épingler une pupe sans en endommager considérablement l'enveloppe (puparium) . Pour éviter cela, on a l'habitude de monter les pupes en les collant sur des cartons qui sont ensuite épinglés (Fig. 8.3 D). Après avoir ajoute une étiquette datée, on place les spécimens dans la boîte.

8.3.4 Etiquetage. Tous les spécimens doivent être étiquetés. L'étiquette doit porter les renseignements suivants :

Lieu exact de la capture
Date de la capture
Nom du captureur
Nom de l'insecte (s'il est connu)
Toute autre information particulière

Quelquefois l'étiquette est retournée afin de pouvoir être lue lorsque la mouche est saisie et examinée'par-dessous (Fig. 8.3 F). Cette disposition est particulièrement utile lorsque deux étiquettes sont utilisées.

8.3.5 Conservation. La collection de mouches épinglées devra être conservée dans une boîte étanche à l'air, doublée de liège ou d'un substitut du liège (polyéthylène expansé réticulé). Les boîtes pourront être en bois, ou être dotées d'un dessus en verre qui permet de voir les insectes sans enlever le couvercle. Dans la plupart des cas, c'est la boîte en bois doublée de liège qui convient le mieux.

Les mouches non épinglées pourront être conservées entre plusieurs couches de rembourrage (plusieurs couches de papier de soie) avec leurs étiquettes qui seront entassées dans une boîte étanche à l'air.

8.3.6 Préservation. Pour éloigner les petits insectes qui pourraient dévorer les spécimens, on épinglera dans un coin de la boîte un petit sac d'étoffe contenant du paradichlorobenzène. La plupart des boîtes que l'on trouve dans le commerce sont munies de rainures dans lesquelles on peut mettre le paradichlorobenzène. Celui-ci devra être renouvelé au bout de quelques mois.

On trouve quelquefois du paradichlorobenzène dans les magasins qui vendent des produits d'entretien comme l'antimite en billes, par exemple.

8.3.7 Manipulation des mouches épinglées. Pour manipuler les mouches, il est préférable d'utiliser une paire de pinces entomologiques courbes (Fig. 8.3 C). Elles permettent de saisir fermement l'épingle, juste sous la tête. On peut ensuite soulever le spécimen et l'examiner. On veillera à ne pas toucher l'insecte lui-même car il se brise facilement. Si la tête ou une autre partie vient à se détacher, on la refixera immédiatement a sa place à l'aide d'une gouttelette de colle (celle qu'on utilise pour le plastique).

8.3.8 Pièces conservées à l'état humide. Les mouches épinglées se dessèchent pendant les premiers jours de conservation de sorte que les parties molles sont inutilisables pour des études ultérieures. Les tissus mous des tsé-tsé peuvent être nécessaires pour la préparation de coupes microscopiques ou pour l'examen des ovaires, et en pareil cas, les spécimens doivent être conservés à l'état humide.

Si l'on se propose de pratiquer ultérieurement des coupes, le produit de conservation le plus couramment utilisé est la solution de Bouin. En principe, ce liquide est vendu prêt à l'emploi. Il contient une substance toxique jaune, l'acide picrique, aussi faut-il le manipuler avec précautions. On peut conserver des pièces anatomiques pendant quelques semaines dans cette solution avant de les utiliser.

On utilise souvent un autre liquide pour conserver des tissus de tsé-tsé avant de les disséquer: il s'agit de la solution de Machado, qui a la composition suivante:

Alcool à 90–95 pour cent-10 volumes
Eau distillée-  4 volumes
Acide acétique glacial-  1 volume
Glycérine-  1 volume

8.3.9 Macération. On peut avoir besoin d'utiliser des pièces anatomiques de mouches desséchées pour l'examen microscopique. C'est souvent le cas lorsque l'on veut identifier l'espèce à laquelle appartient la mouche: en général, ce sont les organes génitaux externes du mâle (génitalia) que l'on examine dans ce but. Pour rendre transparentes les parties molles, il faut chauffer le spécimen pendant quelques minutes dans la potasse caustique (KOH) à 10 pour cent. Ce traitement élimine les tissus indésirables et ne laisse subsister que les structures chitinisées que l'on peut ensuite monter pour l'examen microscopique (voir 10.1.4.2 pour les détails pratiques). On peut aussi employer la potasse à 5 pour cent à la température ordinaire pendant 48 heures, ou le liquide de Marc André (eau distillée 300 g; hydrate de chloral 400 g; acide acétique 300 g) à froid pendant 24 heures ou à chaud pendant 10 min.

8.4 DETERMINATION DU TAUX D'INSEMINATION ET DU TAUX DE GRAVIDITE

Une estimation du taux d'insémination et du taux de gravidité est parfois nécessaire aux fins de la recherche. En principe, ces deux examens sont pratiqués en même temps sur le même échantillon de mouches.

Si. une mouche est gravide, elle aura toujours été inséminée; en revanche une mouche inséminée n'est pas toujours gravide. Ce travail exige un microscope binoculaire.

8.4.1 Taux d'insémination. C'est le pourcentage de femelles dont les spermathèques contiennent des spermatozoïdes. Pour voir si une femelle a été inséminée, il faut disséquer un spécimen frais.

Placer la mouche femelle, reposant sur sa face ventrale, sur une lame porte-objet; faire, à l'aide de ciseaux ou d'une fine lame de scalpel, une petite entaille de chaque côté de l'abdomen, entre les segments 6 et 7. Avec une paire de pinces, tirer vers l'arrière l'extrémité postérieure de l'abdomen, ce qui fait apparaître les organes reproducteurs. Repérer les deux spermathèques.

Elles se présentent sous la forme de deux corps sphériques marron clair places entre les deux ovaires, de couleur blanche (Fig. 2.5). Au moyen d'une paire de pinces, on retire les spermathèques en les saisissant par les conduits spermathécaux et on les place dans une gouttelette de solution saline déposée sur une lame porte-objet. On place une lamelle sur la préparation. En général, s'il y a des spermatozoïdes dans la spermathèque, on peut les voir avec un grossissement de 100 sous l'aspect d'une masse sombre près de la sortie de la spermathèque (Fig. 8.4). Quelquefois, ils remplissent la totalité ou la presque totalité de celle-ci. Si la présence de spermatozoïdes est douteuse, on pourra écraser doucement la préparation (et pomper un peu de solution saline en touchant le bord de la lamelle avec un morceau de papier filtre) et examiner au microscope à contraste de phase. S'il y a des spermatozoïdes, on pourra alors les distinguer.

La spermathèque d'une femelle vierge est claire, elle ne présente aucune zone voilée ou opaque à proximité de l'orifice de sortie et l'on ne peut déceler aucun spermatozoïde lorsqu'on l'observe en contraste de phase après écrasement.

Il n'est pas facile de rechercher la présence de spermatozoïdes dans les spermathèques de mouches desséchées ou conservées dans un liquide conservateur. Seuls des spécimens frais sont utilisables.

8.4.2 Taux de gravidité. Le taux de gravidité est le pourcentage de femelles dont l'utérus contient un oeuf ou une larve.

Pour voir si une femelle est gravide, on en dissèque un spécimen avec des pinces d'horloger comme il est indiqué au paragraphe 8.4.1. Une fois qu'on a situé l'utérus on l'ouvre afin de voir s'il contient un oeuf ou une larve.

Fig. 8.4

Fig. 8.4 Aspect microscopique du sperme à l'intérieur des spermathèques (× 100).

On examinera également le tube qui contenait la mouche captive pour voir s'il n'y a pas eu avortement avant la dissection.

Dans de bonnes conditions d'élevage en laboratoire, on peut obtenir un taux de gravidité de près de 100 pour cent.

8.5 DETERMINATION DE L'AGE

L'examen d'une tsé-tsé permet d'en déterminer l'âge. Ce peut être important pour l'étude de la transmission de la maladie. En effet, une mouche relativement âgée a plus de chances qu'une mouche jeune d'être porteuse de trypanosomes venus à maturité.

  1. Parce qu'une mouche âgée aura eu plus d'occasions d'être infectée;

  2. parce que chez une mouche âgée, l'infection a eu le temps de parvenir à maturité (voir chapitre 6).

Les deux principales méthodes pour évaluer l'âge des mouches par examen direct sont:

  1. l'évaluation du degré d'usure du bord postérieure de l'aile;

  2. l'examen des ovaires.

8.5.1 Evaluation du degré d'usure du bord postérieure de l'aile.

8.5.1.1 Données de base. Cette technique a été mise au point pour les mâles de G. morsitans et G. swynnertoni. L'évaluation de l'âge ne sera pas nécessairement applicable aux autres espèces sans étude préalable sur le terrain.

Lorsqu'une mouche sort de sa pupe, les ailes, d'abord molles, se déploient pour prendre leur envergure normale et se durcissent; à ce stade, le bord en est parfaitement lisse, sans déchirures ni irrégularités. Par la suite, cependant, les ailes se déchirent, notamment au niveau du bord de fuite (bord postérieur) lorsque, au cours de son activité diurne, l'insecte frôle la végétation ou les animaux sur qui il se nourrit, ou encore lorsqu'il est attaqué par des prédateurs. A mesure que la mouche vieillit, ses ailes se délabrent et les mouches très âgées ont des ailes dont les bords sont fortement entamés.

Un chercheur a lâche dans la brousse un certain nombre de mâles récemment éclos et les a repris ensuite au bout de différents laps de temps. Il a étudie l'importance des déchirures alaires et fait des croquis représentant des aspects types pour chaque groupe d'âge. C'est sur ces croquis que sont basés les types représentés sur la figure 8.5. Grâce à ce travail, on peut aujourd'hui après avoir capturé un mâle de G. morsitans, comparer le degré d'usure de ses ailes avec un ensemble de croquis types, et en déduire son âge approximatif.

8.5.1.2 Méthode. Le mode opératoire est le suivant:

  1. on n'étudie, en principe, que les ailes des mâles;

  2. on veillera ne pas endommager les ailes lors de la capture sur le terrain;

  3. au laboratoire, on enlève soigneusement les ailes, on les monte sur lame dans une goutte d'eau et on recouvre d'une lamelle;

  4. on examine l'aile au microscope sous faible grossissement et l'on compare le degré d'usure et de déchirure du bord postérieur à ceux des croquis types (Fig. 8.5). Il est certain que l'aile ne ressemble jamais exactement à l'un quelconque des croquis, mais il y en a au moins un auquel elle ressemble plus qu'aux autres. C'est ce croquis qui l'on choisira et dont on inscrira le numéro;

  5. une fois l'aile ainsi classée, on répète l'opération sur les autres mouches. Plus le nombre de mouches examiné est élevé, plus l'estimation de' l'âge moyen des mouches de la population échantillonnée sera précise. Il faut examiner au moins 30 mouches. Cette méthode ne permet d'évaluer que l'âge moyen d'un groupe de mouches et non l'âge d'un individu particulier.

Fig. 8.5

Fig. 8.5 Les six stades d'usure alaire
(selon l'âge).

8.5.1.3 Calcul de l'âge moyen. Pour calculer l'âge moyen de la population de mouches à partir des données de l'analyse des éraillures alaires, on procède comme suit:

  1. on écrit le nombre de mouches classées dans chaque groupe d'usure alaire (Groupe 1 à 6);

  2. le nombre de mouches du Groupe à (ou effectif) est multiplié par 1 (autrement dit, il est inchangé) et le résultat porté dans la colonne voulue. L'effectif du Groupe 2 est multiplié par 2, celui du Groupe 3 par 3, celui du Groupe 4 par 4,4, celui du Groupe 5 par 5,5 et celui du Groupe 6 par 6,9;

  3. tous ces produits sont additionnés et le total obtenu est divisé par le nombre de mouches de l'échantillon. Le résultat obtenu est appelé valeur moyenne des éraillures alaires (VMEA) .

Exemple:

Tableau 8.1

GroupeEffectif du groupeMultiplicateurProduit
1515
220240
39327
454,422
515,55,5
6  06,9    0
Total :40 mouchesTotal :99,5
  (somme des produits)

soit environ   2,7

  1. en se reportant au Tableau 8.2 ci-dessous, on peut obtenir une estimation de l'âge moyen.

Dans notre exemple, la VMEA était de 2,7, ce qui correspond à un âge moyen probable de 20 jours pour l'ensemble de l'échantillon. Il est bien entendu qu'il s'agit d'une moyenne pour toutes les tsé-tsé de l'échantillon. Il ne faut pas en déduire que l'âge d'une mouche prise au hasard dans l'échantillon est de 20 jours.

Tableau 8.2 Correspondance entre la VMEA (valeur moyenne des éraillures alaires) et l'âge moyen probable des mouches de l'échantillon.

VMEAAge moyen probable de la population de mouches (en jours)
1,611
1,812
1,913
2,014
2,115
2,216
2,317
2,418
2,619
2,720
2,821
2,922
3,023
3,124
3,325
3,426
3,527
3,628
3,729
3,830
3,931
4,032
4,233
4,334
4,435
4,536
4,637
4,738
4,839
5,040
5,141
5,242
5,343
5,444
5,545
5,646
5,847
5,948
6,049
--

8.5.2 Examen des ovaires. Pour évaluer l'âge des femelles, il existe une méthode beaucoup plus exacte que l'analyse des éraillures alaires applicable aux mâles. C'est la méthode d'examen des ovaires. Elle implique la dissection de la mouche et l'examen des ovaires et de l'utérus. Bien que plus compliquée que la précédente, en raison de la nécessité de disséquer, elle permet d'évaluer l'âge des individus femelles avec une bonne précision.

Les Figures 8.6 et 8.7 montrent l'aspect des ovaires à différents stades, pendant et après la production d'oeufs successifs. L'âge probable (en jours) correspondant à chaque stade est indique.

Lorsque la mouche a plus de 80 jours, le cycle ovarien se répète en passant par les mêmes stades que du 40eme au 80ème jour (Fig. 8.7). On ne peut donc pas distinguer ces mouches les unes des autres. Toutefois, celles dont les ailes sont très usées appartiennent vraisemblablement aux catégories les plus agées, mais cette méthode doit être interprétée avec réserve.

8.5.2.1 Technique de dissection des glossines femelles. La dissection, dont la description suit, ne peut être effectuée que sur des mouches venant d'être capturées ou sur des mouches mises dans une glacière aussitôt après la capture, et conservées ainsi depuis peu de temps. Lorsque des examens systématiques sont effectués de façon régulière, il faut en noter les résultats sur des fiches d'examen préparées à l'avance (voir ci-après).

  1. Couper (ou arracher) les ailes et les pattes. Examiner les ailes et noter leur degré d'usure, si nécessaire.

  2. Ouvrir l'abdomen pour dégager l'appareil reproducteur femelle. Pour cela, placer la mouche, face dorsale en dessus, sur une lame reposant sur un fond noir. Faire une petite entaille de chaque côté de l'abdomen, entre les segments 6 et 7, en se servant de petits ciseaux ou d'une fine lame de scalpel. A l'aide d'une paire de pinces, tirer doucement vers l'arrière la partie terminale de l'abdomen ainsi sectionné, ce qui dégage l'appareil génital interne et la partie terminale de l'intestin. Ajouter une grosse goutte d'eau distillée ou salée à 0,9%. Noter si la mouche a pris ou non un repas de sang.

  3. Examiner les spermathèques. En estimer l'état de réplétion ou index (0 = spermathèques apparemment vides; 1 à 10 = indices correspondants a la présence de sperme en quantité croissante depuis un minimum jusqu'au remplissage total).

  4. Repérer l'ovaire le plus gros. On peut laisser les ovaires en place, pour les examiner à nouveau ultérieurement, ou les séparer de l'utérus en coupant l'oviducte commun et les transférer, sur une autre lame, dans une goutte d'eau propre, pour les disséquer.

  5. Ouvrir l'utérus et examiner son contenu. Noter si:

    1. l'utérus est vide, ou s'il contient:
    2. un spermatophore;
    3. un oeuf ;
    4. une larve au 1er stade;
    5. une larve au 2ème stade;
    6. ou une larve au 3ème stade.

  6. Examiner à nouveau le plus gros ovaire. Repérer la position du plus gros ovariole (interne ou externe). Si cette détermination est difficile, examiner l'autre ovaire.

  7. Disséquer l'ovaire pour dégager les ovarioles et voir si le plus gros possède une relique folliculaire. Au cas où il aurait été abimé au cours de la dissection, examiner l'ovariole dont la taille est immédiatement inférieure et noter la présence (ou l'absence) d'une relique folliculaire.

  8. Déterminer l'âge physiologique, d'après l'interprétation des résultats ci-après (voir 8.5.2.2).

Nota : 1.   Si la femelle est vierge, il n'est pas nécessaire de rechercher les reliques folliculaire, sauf si l'on veut s'exercer.

  1. Si c'est l'ovariole interne de l'ovaire droit qui est le plus grand, et que l'utérus contient un oeuf ou une larve, il n'est pas nécessaire de rechercher les reliques folliculaires, car chaque ovariole en a une.

  2. Si c'est l'ovariole externe de l'ovaire gauche qui est le plus grand, il faut alors effectuer la dissection avec beaucoup de soins, car l'ovariole immédiatement inférieur en taille (l'interne de l'ovaire droit) possède sûrement une relique folliculaire et ne peut donc pas être une aide pour identifier la catégorie ovarienne.

  3. Une fiche doit être préparée pour noter les renseignements nécessaires :

    Nombre de mouches, sexes, stade d'usure des ailes, stade d'engorgement (mouche ayant, ou non, pris un repas), taux d'insémination (index des spermathèques), position de l'ovaire le plus gros (droit ou gauche), contenu de l'utérus (vide, présence d'un spermatophore, d'un oeuf ou d'une larve et stade de celle-ci), état du plus gros ovariole, présence (ou absence) d'une relique folliculaire dans l'ovariole de taille immédiatement inférieure, âge physiologique ainsi estimé, observations complémentaires si nécessaires.

  4. Si les dissections sont effectuées dans le cadre d'une enquête de contrôle après une pulvérisation d'insecticides en aérosol, il peut être utile de mesurer la longueur du plus grand ovariole (l'interne droit) des mouches de la catégorie 0, a partir de 0,1 mm. Ceci permet de distinguer les très jeunes mouches de celles qui sont légèrement plus âgées, mais appartiennent encore à cette catégorie (femelles nullipares).

OVARIESNOTESAGE ESTIME EN JOURS
GaucheDroit
Fig. 8.6Le follicule A mesure moins de 0,6 mm.1–4
  
  
Le follicule A mesure plus de 0,6 mm4–10
  
Le follicule A est reduit à l'état de relique folliculaire. Le follicule C est le plus grand.10–20
  
Le follicule C est reduit à l'état de relique folliculaire. Le follicule B est le plus grand.20–30
  
Le follicule B est reduit à l'état de relique folliculaire Le follicule D est le plus grand.30–40

Fig. 8.6 Schéma montrant les modifications des ovaires à mesure que la mouche avance en âge (glossines de 0 à 40 jours).

OVARIESNOTESAGE ESTIME EN JOURS
GaucheDroit
Fig. 8.7Le follicule A est le plus grand et il a unerelique folliculaire40–50
Le follicule C est le plus grand et il a une relique folliculaire50–60
Le follicule B est le plus grand et il a une relique folliculaire60–70
Le follicule D est le plus grand et il a une relique folliculaire.70–80

Fig. 8.7 Schéma montrant les modifications des ovaires à mesure que la mouche avance en âge (glossines de 40 à 80 jours).

8.5.5.2 Interprétation des résultats. Les mouches femelles peuvent être classées dans des groupes d'âge, en fonction du contenu de l'utérus, de la taille relative des quatre ovarioles, et de la présence, ou de l'absence, de reliques folliculaires dans ces ovarioles.

L'âge des mouches des catégories 0 à 3 (c.a.d. les mouches n'ayant jamais ovulé, ou ayant ovulé une, deux ou trois fois, voir fig. 8.6) peut être estimé avec une assez grande précision et avec certitude. Par contre les mouches des quatre catégories suivantes (4 à 7) ne peuvent être distinguées avec certitude des catégories suivantes (8 à 11 et 12 à 15). En effet, la relique folliculaire, témoin de la première ovulation, est expulsée avec le 2ème oeuf provenant du même ovariole, si bien que le nombre de reliques reste le même, dans l'ensemble des ovarioles, a partir du 5ème groupe d'âge.

Le schéma des Figures 8.6 et 8.7 résume la façon dont on peut évaluer l'âge d'une femelle. Les deux exemples suivants montrent comment utiliser ce schéma.

1er Exemple: soit une mouche dont l'ovariole interne de l'ovaire gauche est le plus grand; cet ovariole n'a pas de relique folliculaire; l'utérus est contient une larve du 3eme stade. En se référant au tableau, cette mouche appartient a la catégorie 1c; son âge physiologique peut donc être estimé entre 16 et 19 jours.

2ème Exemple: soit une mouche dont l'ovariole externe de l'ovaire droit est le plus grand; cet ovariole a une relique folliculaire; l'utérus est vide. En se référant au tableau, cette mouche appartient aux catégories 6c, 10c ou 14c; son âge physiologique sera alors soit entre 67 et 70 jours, soit entre 107 et 110 jours, soit entre 147 et 150 jours. Il est vraisemblable que la mouche appartient plutôt à la première catégorie (6c) car la durée de vie dépasse rarement 100 jours dans la nature, mais l'évaluation du degré d'usure des ailes peut permettre de préciser la catégorie exacte.

8.6 IDENTIFICATION DES REPAS DE SANG

8.6.1 Données de base. Le but de cette identification est de déterminer sur quels animaux les tsé-tsé se nourissent dans un secteur donné. C'est une donnée utile pour la planification des programmes de lutte et d'éradication. Les études relatives à la collecte et à l'identification des repas de sang sont assez complexes et ne devront être décidées qu'après une planification et des consultations minutieuses.

Avant de commencer à récolter des mouches pour identifier les repas de sang, le responsable de l'enquête devra consulter le laboratoire qui sera chargé de l'identification. Ce dernier indiquera s'il est en mesure d'apporter sa collaboration et, dans l'affirmative, fera des suggestions susceptibles d'aider les agents de terrain.

A l'heure actuelle, les identifications de repas de sang sont effectuées au Laboratoire d'immunologie, Imperial College Field Station, Silwood Park, Sunninghill, Ascot, Berkshire, Royaume-Uni et S l'Institut Robert von Ostertag - D.100 Berlin 33, République fédérale d'Allemagne.

Fig. 8.8

Fig. 8.8 Système d'enregistrement des repas de sang. A, "fiches d'identification de repas de sang"; B, fiche de renseignements sur chaque mouche à partir de laquelle on a effectué des étalements de sang.

8.6.2 Matériel. Le matériel de base comprend des filets, des cages et des tubes numérotés, un dessicateur, des instruments de dissection, du papier filtre et du papier antigraisse. L'idéal serait de disposer d'un réfrigérateur, mais ce n'est pas absolument indispensable. Avant de commencer l'enquête on préparera un certain nombre de fiches d'information vierges (Fig. 8.8 B) et des papiers filtres marqués (voir Fig. 8.9 A). Les fiches d'information devront être remplies au fur et à mesure de la préparation des étalements de sang.

8.6.3 Collecte de spécimens. Pour obtenir les meilleurs résultats, il faut ramasser des mouches récemment gorgées. Ce seront des mouches au repos. L'agent de terrain devra connaître en détail les habitudes et l'écologie locales (voir 7.4) des mouches pour trouver et capturer celles qui sont gorgées. A cet effet, un travail préliminaire est nécessaire.

On peut quelquefois utiliser les mouches prises au piège, mais ce sont le plus souvent des mouches affamées qui ne conviennent donc pas du tout pour l'identification des repas de sang. En enduisant les troncs d'arbres de glu, on peut capturer aussi quelques mouches récemment gorgées.

Les mouches devront être capturées dans divers biotopes de la zone considérée. L'équipe de captureurs ne devra pas explorer seulement quelques biotopes localisés, sans quoi les résultats ne seront pas représentatifs de la zone dans sa totalité. Si possible, on étudiera la zone à différentes époques de l'année, au cas où les habitudes alimentaires varieraient avec la saison.

Un trop petit nombre de mouches, par exemple 20, ne donnera pas de renseignements utiles; a la vérité, il peut même conduire à des erreurs. Pour toute enquête, il faut au moins une centaine d'étalements de sang.

8.6.4 Préparation des spécimens et des dossiers. Les mouches capturées sur le terrain seront ramenées au camp ou au laboratoire le plus vite possible et identifiées. On pourra les conserver dans une glacière ou un réfrigérateur, si on en a un, en attendant de les disséquer. Cette mesure permet de retarder la digestion du repas de sang.

On prépare ensuite les étalements de sang et les dossiers en opérant comme suit, avec chaque mouche:

  1. inscrire sur une fiche d'information (Fig. 8.8 B), en face de la lettre et du numéro correspondant du papier filtre (voir Fig. 8.9 A) les renseignements suivants: espèce, sexe, degré de réplétion de l'abdomen, et autres observations;

  2. sectionner l'abdomen avec un scalpel propre ou des ciseaux;

  3. à l'aide d'une pince propre, retirer de l'abdomen l'intestin rempli de sang et le déposer sur un papier filtre Whatman № 1 (sur lequel on a, au paravant, tracé au crayon le schéma indiqué à la figure 8.9 A), sur la case libre située juste à côté de celle où l'on a déposé le repas de sang précédent ;

  4. étaler le sang sur le papier filtre en appuyant avec le plat de la lame du scalpel. (Ce qui reste de la mouche est rejeté, à moins que l'on en ait besoin pour d'autres études);

  5. laver les instruments de dissection à l'eau propre, bien les essuyer avec des serviettes en papier propre, les laver une nouvelle fois et vérifier leur propreté avant de préparer la mouche suivant.

    Si les instruments sont mal nettoyés les résultats seront erronés.

Fig. 8.9

Fig. 8.9 Exécution des étalements de sang. A, préparation d'un étalement par dissection de l'intestin et transfert sur papier filtre; B, conservation des papiers filtre dans un dessicateur entre des feuilles de papier antigraisse.

8.6.5 Conservation des étalements de sang. Lorsqu'on aura rempli un papier filtre (8 étalements), on le déposera avec soin dans un dessicateur et on placera par-dessus une feuille de papier antigraisse coupée à la même dimension. Ainsi les étalements n'entreront pas en contact avec ceux du papier filtre suivant. Si l'on possède un réfrigérateur, on y placera le dessicateur (à 4° C). Si l'on ne dispose pas de dessicateur, les papiers filtres peuvent être conservés dans une boîte, ou un bac plastiques, étanches à l'air, et contenant du silicagel. Celui-ci est bleu lorsqu'il est frais; s'il devient rosé, l'étaler sur une plaque de métal que l'on chauffe doucement jusqu'à ce qu'il redevienne bleu.

On remplira ensuite une "fiche d'identification de repas de sang", en y portant les renseignements suivants: date, détails relatifs a la zone de capture, notamment la liste des hôtes possibles, le lieu exact et les espèces de glossines présentes (voir Fig. 8.8 A).

Les papiers filtre pourront être conservés quelques semaines dans ces conditions mais jamais plus de 1 à 2 mois. Accompagnés de leur feuilles de séparation antigraisse, des fiches de renseignements et des “fiches d'identification de repas de sang”, ils seront placés dans un emballage imperméable et expédiés sous pli fermé par poste aérienne au laboratoire identificateur.

L'identification pourra prendre quelques semaines et le laboratoire pourra demander des détails supplémentaires pour faciliter sa tâche.

8.7 DETERMINATION DU TAUX D'INFECTION PAR LES TRYPANOSOMES

Le taux d'infection par les trypanosomes est le pourcentage de mouches porteuses de trypanosomes parvenus a maturité (pleinement développés) au niveau de l'intestin, de la trompe ou des glandes salivaires

Pour déterminer le taux d'infection, on dissèque ces organes et on les examine au microscope. Le taux d'infection dépend de l'âge de la mouche qui doit donc être déterminé également (voir 8.5).

8.7.1 Comment tuer les mouches? Les dissections doivent être pratiquées sur des mouches fraîchement tuées. Pour tuer les mouches, on peut utiliser des vapeurs d'éther, de chloroforme ou d'acétate d'éthyle (voir 8.3.1). On peut aussi immobiliser l'insecte en lui comprimant doucement le thorax, mais il faut veiller à ne pas endommager la mouche sans quoi la dissection ne serait plus possible: On disséquera la mouche le plus rapidement possible après l'avoir tuée.

8.7.2 Dissection des mouches. Une fois la mouche tuée, on coupe ou on arrache ailes et pattes. Normalement, on examine les organes suivants: trompe, intestin moyen, proventricule et glandes salivaires. Les pièces anatomiques sont disséquées dans une solution glucosée à 5 pour cent (ou une solution saline à 0,9 pour cent) et examinées au microscope sous un grossissement de 400 à la recherche des trypanosomes.

Méthode 1 (méthode longue)

a) Glandes salivaires. On utilise une loupe binoculaire donnant un grossissement de 20 ou 30. Découper une mince bande sur les côtés gauche et droit de l'abdomen. Epingler la mouche sur un plateau enduit de cire, face ventrale vers le haut I l'aide de 2 épingles enfoncées dans les angles antérieurs du thorax; la recouvrir de solution saline ou de solution glucosée. Couper transversalement la face ventrale de l'abdomen au niveau de l'extrémité antérieure, la retourner et l'épingler. Rechercher les glandes salivaires dans les coins antérieurs de l'abdomen et les extraire doucement à l'aide d'une pince d'horloger. Après les avoir extraites l'une après l'autre, les déposer dans une goutte de solution glucosée sur une lame et les recouvrir d'une lamelle. Rechercher au microscope les trypanosomes I l'intérieur de la glande sous un grossissement de 400.

b) Trompe. On pourra enlever la trompe pour l'examiner séparément. Séparer les trois parties (labium, hypopharynx et labre) et les étaler en éventail (Fig. 8.10) dans une solution de glucose. Recouvrir d'une lamelle. Examiner au microscope les pièces disséquées, en particulier l'hypopharynx, sous un grossissement de 400.

c) Intestin moyen. Retirer alors l'intestin, le découper en petits fragments et l'examiner au microscope (400 ×) de la mime manière. Si l'on veut examiner le proventricule, on le trouvera en enlevant la face ventrale du thorax et en découvrant le ganglion nerveux thoracique. Il suffit d'extraire précautionneusement celui-ci pour trouver juste en-dessous le proventricule que l'on pourra retirer à l'aide d'une pince d'horloger.

Méthode 2 (plus rapide mais moins précise)

a) Glandes salivaires. Maintenir la mouche avec une paire de pinces, et avec une autre pince, lui détacher la tête du thorax en la tirant vers l'avant; les glandes salivaires restent attachées à la tête et sortent du reste du corps. Si elles se rompent, on pourra toujours les extraire a la pince. Monter immédiatement les glandes dans une solution de glucose à 5 pour cent, les recouvrir d'une lamelle et les examiner au microscope (Fig. 8.11).

b) Trompe. Détacher la trompe en saissisant le bulbe avec des pinces et en l'arranchant du reste de la tête. Monter ensuite comme ci-dessus.

c) Intestin moyen. Sectionner les 2 ou 3 derniers segments de l'abdomen et les enlever. Placer la partie antérieure de l'abdomen sur une lame, en contact avec une goutte de solution saline ou de solution glucosée; faire sortir les viscères dans la solution en appuyant légèrement sur l'abdomen avec une aiguille posée transversalement et déplacée d'avant en arrière. Rejeter l'abdomen vide et recouvrir les viscères d'une lamelle. Examiner au microscope, après avoir légèrement appuyé sur la lamelle pour étaler la préparation.

Fig. 8.10

Fig. 8.10 Aspect microscopique du canal alimentaire et de l'hypopharynx d'une glossine infestée de trypanosomes.

Fig. 8.11

Fig. 8.11 Dissection des pièces buccales et des glandes salivaires d'une tsé-tsé (Glossina brevipalpis), montrant la différence d'aspect entre une glande salivaire infectée et une glande salivaire non infectée

8.8 MESURE DE LA TAILLE DE LA GLOSS1NE

On utilise 2 méthodes pour cette mesure. La première consiste a mesurer la longueur du «tranchant» de la cellule alaire en hachette; la seconde consiste à mesurer le thorax.

8.8.1 Longueur de la nervure alaire. Couper les ailes et les monter pour examen au microscope. On mesure la longueur du «tranchant» de la cellule en hachette (Fig. 8.12 A, longueur X) I l'aide d'un oculaire muni d'un micromètre. On fait la mesure sur chacune des deux ailes et l'on prend la moyenne. On pourra en même temps estimer l'âge d'après l'usure des ailes (voir 8.5.1).

8.8.2 Taille du thorax. Cette méthode donne une dimension plus exacte de la taille réelle des mouches. Elle consiste a multiplier entre elles les deux longueurs suivantes, effectuées sur le thorax:

  1. distance entre les points d'insertion des plus grandes des soies humérales situées de chaque côté du thorax (Fig. 8.12 B, longueur Y);

  2. distance entre la base des soies scutellaires médianes et la suture transverse mésonotale (Fig. 8.12 B, longueur Z).

Ces deux longueurs sont mesurées au moyen d'une loupe binoculaire munie d'un oculaire micrométrique.

Fig. 8.12
Fig. 8.12

Fig. 8.12 Mesures permettant d'apprécier la taille d'une glossine; A, "tranchant" (X) de la "cellule en hachette"; B, distance (Y) entre les points d'insertion des plus grandes soies humérales situées de chaque coté du thorax; distance (Z) entre le point d'insertion des soies scutellaires et la suture transverse mésonotale.


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