Los fitomejoradores tienen en su poder muchas herramientas para aplicar en el trabajo práctico, si bien los programas mas avanzados de mejoramiento de maíz en los trópicos usan unas pocas de las que están disponibles. Sin embargo, el potencial del arma mas poderosa, el maíz híbrido, debe aún ser debidamente explotado en los trópicos. Aún en las zonas templadas, donde se han hechos progresos revolucionarios en el mejoramiento de la productividad del maíz a escala comercial, Duvick (1996a,b) cree que el arte y la ciencia del fitomejoramiento convencional basado en la hibridación planificada para la obtención de nuevos genotipos seguida por cuidadosas pruebas y selecciones en el campo continuarán siendo la metodología principal para obtener ganancias genéticas continuas y una mayor productividad de los futuros cultivares. De cualquier manera, algunos de los instrumentos ahora disponibles tienen el potencial suficiente como para incrementar la eficiencia de los métodos convencionales de mejoramiento.
Los nuevos instrumentos disponibles en manos de los fitomejoradores que se mencio-narán en este capítulo se pueden clasificar en tres grupos principales: (a) cultivo y selección in vitro; (b) análisis de los genomios a nivel molecular y selección asistida de los marca-dores y, (c) ingeniería genética y recombina-ción del ADN. En sentido estricto, todo el fitomejoramiento es ingeniería genética ya que involucra la alteración de los componentes genéticos de las plantas por medio de la intervención humana, comparada con la evolu-ción y la selección natural. La moderna inge-niería genética comprende la manipulación directa del ADN, o sea la tecnología de la recombinación del ADN, para eliminar o agregar genes específicos, incluyendo genes de fuentes extrañas que no pueden ser transferidos por los métodos convencionales. La biotecnología es la aplicación de las técnicas de biología e ingeniería a la manipula-ción genética de las plantas e involucra en la práctica todas las actividades. King y Stansfield (1985) prepararon una lista exhaus-tiva y definiciones de los términos relacio-nados con la genética y con la ingeniería genética, útiles para una mejor comprensión de estas nuevas actividades.
Se ha especulado y se ha esperado que la nueva ciencia de la biotecnología pudiera ayudar en la obtención de ganancias mas rápidas en caracteres difíciles de manejar o que no podían ser mejorados por los métodos convencionales de fitomejoramiento. Sin embargo, hasta ahora, la biotecnología no ha producido tales resultados rápidos o especta-culares. Muchas de las herramientas de la biotecnología son muy lentas o son muy caras para tener un impacto significativo en el desarrollo de nuevas variedades (Duvick, 1996a). Sin embargo, los recientes adelantos en biología molecular, la ciencia madre de la biotecnología, han sido consistentes y revolucionarios y es de esperar que algunas de esas nuevas herramientas, si son usadas en forma correcta y eficiente, puedan ser de indudable ayuda al fitomejoramiento (Brenner, 1991; Smith y Paliwal, 1996; Duvick, 1997). Hoy día, se pueden hacer algunas preguntas sobre la utilidad y el posible impacto de la biotecnología en el mejoramiento del maíz ya que no hay antecedentes sobre los cuales se puedan hacer predicciones definidas. La eficiencia de los esfuerzos del fitomejoramiento puede ser fortalecida por una mejor compren-sión de las relaciones de los genomios, de las interrelaciones, de la identificación de alelos útiles y de su transferencia a líneas y varie-dades selectas, especialmente en el caso de caracteres complejos, esquivando así las barreras de la transferencia sexual de los genes y el desarrollo de genotipos de maíz con valor agregado. El uso de la biotecnología tiene importantes implicancias técnicas, financieras y de propiedad que deben ser analizadas y comprendidas claramente antes de comenzar a aplicar la biotecnología como una herra-mienta en el fitomejoramiento del maíz.
Las herramientas especiales que se discu-tirán en este capítulo, incluyen: cultivo y selección in vitro de tejidos, células y proto-plastos; análisis del genoma a nivel molecular; selección de marcadores asistidos y transformaciones y recombinaciones del ADN.
La regeneración de plantas a partir de cultivos de células somáticas in vitro es una de las herramientas básicas de la biotecnología. Es usada para la manipulación genética, la selección, la variación somaclonal, el cultivo de protoplastos, el cultivo de anteras, la recombinación del ADN y la regeneración de plantas transformadas, o transgénicas. El maíz no es una planta fácil de regenerar por medio del cultivo de células o tejidos. Green y Phillips (1975) fueron los primeros que informaron sobre la regeneración exitosa de plantas de maíz a partir del cultivo de tejidos. Hoy día, las técnicas de cultivo de células y tejidos de maíz han sido mejoradas en forma sensible y son comparables con el amplio espectro de sistemas en estudios genéticos que se aplican en otras especies. Phillips, Somers y Hibberd (1988) hicieron una revisión completa de la manipulación in vitro del cultivo de células y tejidos de maíz. Los protocolos para la regeneración de callos y plantas de maíz de diferentes explantes -porción de la planta y tipo de tejido usado para la regeneración- han sido descriptos por varios autores en The maize hand-book editado por Freeling y Walbot (1994). La iniciación y el mantenimiento de cultivos de células y tejidos de maíz y la exitosa regeneración de las plantas depende del genotipo usado, de la elección de los tejidos, del estado de desarrollo de la planta, del medio de cultivo y del ambiente en cada etapa del proceso de cultivo (Phillips, Somers y Hibberd, 1988; Armstrong, 1994).
Los germoplasmas de maíz mas comúnmente usados para el cultivo de tejidos son las líneas endocriadas de zona templada A 188 y B 73 y los híbridos F1 de estas dos líneas. Los híbridos F1 de A 188 x B 84 tam-bién han sido cultivados y usados exitosa-mente para la regeneración de plantas transgénicas fértiles (Phillips, Somers y Hibberd, 1988; Gordon-Kamm et al., 1990; Armstrong, 1994). Sachan et al. (1993) informa-ron acerca del cultivo y regeneración exitosa in vitro de plantas fértiles a partir de glumas de espiguillas jóvenes de la línea endocriada CM 11 x Teosinte. Solamente en los últimos tiempos las líneas endocriadas de maíces tropicales, subtropicales y de altura han sido regeneradas por medio de cultivos in vitro. Bohorova et al., (1995), en el CIMMYT, identi-ficaron algunas líneas endocriadas de germoplasma no templado y la composición de los medios de cultivo que dio buenos resul-tados en estos casos. Las líneas endocriadas CML 67, CML 72 y CML 128 tuvieron el mas alto potencial de regeneración. Armstrong, Romero-Severson y Hodges (1992), informaron que hay un gen o genes importantes en el brazo mas largo del cromosoma 9 en la línea endo-criada templada A 188 que promovió -o promovieron- la iniciación de los callos y la regeneración de la planta. Prioli y Silva (1989) encontraron que el germoplasma de la raza de maíz tropical Cateto mostraba una mayor frecuencia de regeneración que la raza Tuxpeño. Bohorova et al., (1995) concluyeron que dos líneas endocriadas de maíz tropical, CML 67 y CML 72, que mostraron el mas alto potencial de regeneración pertenecían a la raza Antigua y que esta raza poseía un gen o genes responsables por una mejor regeneración de las plantas.
Los embriones inmaduros han sido los explantes mas extensivamente usados para la iniciación de cultivos de tejidos diploides regenerables. Otros explantes usados para la regeneración son secciones de raíces, meso-cotilo, nudos de coleoptilo, vástagos de plán-tulas, secciones de tallos, internudos y embriones maduros. El endospermo ha sido usado para cultivo de tejidos triploides. Phillips, Somers y Hibberd (1988) prepararon una lista de autores y de objetivos para iniciar la regeneración.
Los cultivos de maíz regenerables son por lo general clasificados como tipo I o tipo II. Phillips, Somers y Hibberd (1988), Armsrtong (1994) y otros han descripto las características de estos dos tipos de cultivos. Los cultivos de tipo I no son friables, no se subdividen o rompen automáticamente y deben ser repi-cados con la ayuda de escalpelos y pinzas; se regeneran por medio de embriogénesis somá-tica y también por organogénesis, son alta-mente diferenciados y a menudo contienen estructuras similares a hojas y estados avan-zados de embriones somáticos. Los cultivos del tipo II son muy friables, se repican fácilmente, se regeneran casi exclusivamente por embriogénesis somática, son relativamente indiferenciados y tienen numerosos embriones globulares en estado somático que no se desarrollan en los medios de mantenimiento. Estos cultivos de tipo II son preferidos para muchos usos, sobre todo a causa de la escasa diferenciación y de la friabilidad, lo cual hace que la selección in vitro y el establecimiento de suspensiones líquidas de cultivos sean mucho mas simples.
La selección in vitro es posible debido a que las células de las plantas en los medios de cultivo son genéticamente variables. Los tejidos de los callos, plántulas o plantas derivadas de cultivos in vitro no son nece-sariamente idénticos al explante usado para el cultivo. La variación en las células y tejidos cultivados es llamada variación somaclonal; tal variación no se limita solo a la primera generación regenerada sino que se transmite también a la progenie de la misma. El cultivo de células es considerado como un medio para seleccionar preferentemente líneas de células con una mutación. La selección exitosa de cultivos de tejidos depende de la evaluación y la comprensión del agente de selección de los medios culturales del maíz (Somers y Hibberd, 1994). El agente para la selección de los medios culturales es elegido en base a observaciones sobre los efectos específicos sobre otros organismos y plantas. Las pruebas bioquímicas tales como los ensayos in vitro de inhibición de enzimas y la medida de los niveles de metabolitos en respuesta a los agentes selectivos, determinan el éxito o el fracaso del agente selectivo. Las plantas regeneradas a partir de líneas de células selec-cionadas en muchos casos expresaron el nuevo carácter a nivel de toda la planta, dando mayor valor agronómico para ese carácter particular. Usando un agente selectivo espe-cífico para seleccionar preferentemente una línea determinada de células, puede ser posible reducir el número de plantas que participan en todo el proceso de selección (Smith, Duncan y Bhaskaran, 1993). Lorz (1989) comentó que muchas de las variaciones somaclonales no tienen mayor valor para el mejoramiento de las plantas y por otro lado Phillips, Somers y Hibberd (1988), Anderson y Georgeson (1989), Smith, Duncan y Bhaskaran (1993) y Somers y Hibberd (1994) han dado ejemplos de caracteres útiles mejorados por medio de la selección in vitro. La selección para resis-tencia al tizón sureño de la hoja, para tolerancia a los herbicidas y para un mayor contenido de triptófano son ejemplos de selecciones exitosas obtenidas a partir de cultivos in vitro. El cultivo in vitro de microsporas, de granos de polen y de anteras para el desarrollo de callos haploides y plantas y el desarrollo posterior de líneas endocriadas completa-mente homocigotas por medio de haploides duplicados ha sido discutido en el capítulo Citogenética1 del maíz tropical. El cultivo in vitro de tejidos haploides ha progresado considerablemente en los últimos años y es probable que en el futuro sea cada vez mas usado por los fitomejoradores de maíz.
Los protoplastos también pueden ser usados para el cultivo in vitro y la manipula-ción genética por medio de la incorporación de ADN extraño, por medio de la fusión de protoplastos de diferentes tipos de maíz o de otras especies y también por variantes genera-cionales o somaclonales (Shillito, Carswell y Kramer, 1994). Los tejidos del mesofilo han sido muy usados como fuente de protoplastos (Vasil, 1983; Phillips, Somers y Hibberd, 1988). La preparación de protoplastos para el cultivo de callos y su regeneración ha sido descripta por Vasil y Vasil (1987). Sin embargo, el cultivo de callos de protoplastos de plantas enteras no ha sido, por lo general, exitoso (Phillip, Somers y Hibberd, 1988; Shillito, Carswell y Kramer, 1994). Por otro lado, hay algunos informes sobre la regeneración de plantas fértiles a partir de protoplastos de maíz (Cai et al., 1987; Shillito et al., 1989). Es posible que pronto se llegue a la división exitosa de protoplastos y a la formación sostenida de callos regenerados, tal como ha sido sugerido por Shillito et al., (1989). Cuando esto ocurra, será posible la hibridización a través de la fusión y transformación de los protoplastos por absorción directa del ADN en los proto-plastos por medio de manipulación genética in vitro.
Muchos de los mas importantes logros del fitomejoramiento del maíz en lo que hace al aumento de la productividad y de la calidad se han obtenido por fitomejoradores prácticos sin mayores conocimientos ni apoyo de los procesos biológicos básicos de las plantas; sin embargo, ahora se reconoce cada vez mas que el conocimiento de la biología de las plantas y de la genética molecular abren nuevos caminos para avances mas rápidos y de mayor impacto en el mejoramiento de los cultivos. Los marcadores de ADN propor-cionan el eslabón fundamental para unir la biología de las plantas y el fitomejoramiento. Esto es particularmente cierto en el caso del maíz ya que este ha sido detalladamente estu-diado a nivel molecular y a nivel de su poli-morfismo nuclear del ADN2 y ha sido utilizado para el análisis de los genomas y la selección de marcadores asistidos.
Una revisión profunda de los marcadores de ADN y su papel en el mejoramiento de los cultivos fue publicada por Paterson, Tanksley y Sorrells (1991). Un libro titulado DNA based markers in plants, editado por Phillips y Vasil (1994) es también una buena fuente de informa-ción sobre la importancia y el uso de marca-dores del ADN. Otra revisión reciente que enfatiza las aplicaciones y la importancia de los conceptos modernos de la biología en el fitomejoramiento ha sido escrita por Lee (1995) en ADN markers and plant breeding pro-grams.
La tecnología de clonación de genes ha hecho importantes adelantos en muchas áreas de la biología; una de estas es el uso de frag-mentos clonados de DNA cromosómico como marcadores genéticos. En este proceso el ADN es digerido por medio de una enzima de restric-ción; estas enzimas son una clase de endonu-cleasas del ADN que se encuentran en varios microorganismos. Las enzimas de restricción del tipo II pueden romper el ADN en lugares con una secuencia base específica, precisa-mente en el lugar de restricción. Los fragmentos homológos restringidos de ADN obtenidos por medio de este clivaje son usados como marcadores genéticos.
Este proceso es ampliamente usado para la constitución de mapas genéticos y es cono-cido como mapeo de Polimorfismo de Restric-ción de la Longitud de los Fragmentos (sigla en inglés: RFLP)3.. Hoisington y Coe (1990) y Gardiner et al., (1993) publicaron los mapas genéticos principales del maíz usando el método RFLP. Otras técnicas desarrolladas para la detección del polimorfismo y para elegir marcadores ligados en las poblaciones segre-gantes son pruebas de ADN Polimórfico Asignadas al Azar (sigla en inglés: RAPD), de Polimorfismo Amplificado de la Longitud de los Fragmentos (sigla en inglés: AFLP) y otras pruebas basadas en PCR.
Muchos de los caracteres agronómicos son de naturaleza cuantitativa. La caracteriza-ción de los elementos genéticos que afectan la variación genética cuantitativa son especial-mente importantes para los fitomejoradores. El mapeo genético de los loci de caracteres cuantitativos (sigla en inglés: QTL) con marcadores ADN ha abierto grandes oportu-nidades. Varios autores han escrito varios trabajos sobre el uso de marcadores ADN para detectar QTL (Dudley, 1993; Knapp, 1994; Phillips y Vasil, 1994), sobre QTL y heterosis (Stuber, 1994a; Dubreil, 1996) y sobre interac-ciones genotipo x ambiente en el análisis QTL (Beavis y Keim, 1995). Lee (1995) actualizó la información sobre estos y otros aspectos de los marcadores de ADN en el fitomejoramiento.
Los mapas genéticos de QTL usando marcadores del ADN, han sido integrados en muchas especies. Estos han proporcionado nuevos enfoques en la determinación del orden y las funciones biológicas de las regiones de los genomas de distintos cereales. Cuando la tecnología molecular fue aplicada para preparar mapas cromosómicos mas densos, se creyó que esta podría ser útil para determinar mas precisamente las diferencias entre distintas especies y que los mapas genéticos serían exclusivos para cada especie. Al contrario de lo esperado, ahora es posible buscar las similitudes en los genomas de esas especies. El análisis molecular de los genomas ha mostrado homologías y las relaciones que se conservan entre varios cereales. Tales referencias cruzadas crearon oportunidades para trazar estrategias para clonar genes e investigaciones sobre la evolución de los genomas. El uso de juegos comunes de pruebas de ADN para detectar y mapear secuencias homólogas y las relaciones obser-vadas entre especies sexualmente aisladas, por ejemplo maíz, arroz, sorgo y trigo, está abriendo mas oportunidades para los genetistas y los fitomejoradores. Los análisis de genética molecular han revelado homologías y las relaciones anteriores y conservadas entre el maíz y el sorgo (Hulbert et al., 1990; Whitkus, Doebley y Lee, 1992; Pereira y Lee, 1994; Pereira et al., 1994), entre el maíz y el arroz (Ahn y Tanksley, 1993) y entre el maíz y el trigo (Devos et al., 1994). Ahn et al., detectaron grandes homologías entre el maíz, el arroz y el trigo en varias regiones de los genomas. Una de estas es el locus que gobierna la ausencia de lígulas, una etapa importante en la domesticación de los granos. Moore et al., (1995a) informaron sobre la evolución de los genomios de seis gramíneas importantes, incluyendo el maíz. El genomio del arroz es uno de los mas pequeños entre las gramíneas, y usando el análisis de la unión de los segmentos del arroz demostraron que los genomios de seis especies de gramíneas pueden ser alineados disectando los cromosomas individuales en segmentos y reordenando los bloques de las uniones conservadas en estructuras sumamente simi-lares. Este análisis ha llevado a la interesante hipótesis o a la posibilidad de que haya un único cromosoma ancestral de los cereales (Moore et al., 1995a,b)4.
Se ha encontrado ahora que los tipos de uniones anteriores conservadas y sus funciones incluyen los QTL y que los bene-ficios comparativos de los mapas genéticos para los programas de fitomejoramiento son importantes tanto a corto como a largo plazo (Lee,1995). Los marcadores moleculares pueden ser usados para identificar QTL únicos de diferentes recursos genéticos para caracteres complejos tales como tolerancia al estrés, adaptación y caracteres de calidad. Los QTL para algunos caracteres cuantitativos clásicos tales como altura de las plantas se encuentran cercanos a loci de caracteres cualitativos que afectan las mismas carac-terísticas (Beavis et al., 1991). Los estudios de genética molecular han permitido de este modo la disección de caracteres fenotípica-mente correlacionados. Muchos QTL para una mayor concentración de aceite están asociados a un menor peso de los granos; sin embargo, se ha encontrado que algunos loci dentro de estas regiones de los QTL están asociados con un carácter pero no con otro (Goldman, Rocheford y Dudley, 1994; Berke y Rocheford, 1995). Tal información debería permitir a los fitomejoradores seleccionar alelos deseables introgresivos para un carácter que no se espera que lleve asociados efectos indeseables.
El análisis de genética molecular ha intentado relacionar la heterosis, medida bajo la forma de rendimiento, a la diversidad de los marcadores entre los parentales o dentro de los híbridos simples. Los marcadores mole-culares pueden detectar asociaciones entre las líneas endocriadas que se correlacionan favorablemente con datos del pedigrí, pero no han sido efectivos para predecir efectos espe-cíficos de la habilidad combinatoria (Dubreil et al., 1996). Las técnicas de los marcadores moleculares no son tan efectivas para predecir la heterosis pero sin embargo, han aportado información para comprender la complejidad del fenómeno. Los marcadores moleculares están siendo cada vez mas usados en los cruzamientos amplios del maíz. La detección del modo apomíctico de reproducción de los híbridos maíz x Tripsacum fue posible gracias al uso de los marcadores RFLP del maíz (Le-blanc et al., 1995, 1996). Un ejemplo de hibrida-ción exitosa de maíz con una especie fuera de la tribu de las Maideas fue descripta recientemente por Lizarazú, Rines y Phillips (1996) involucrando cruzas de avena con maíz; se identificaron algunos híbridos parciales estables con uno a cuatro cromosomas del maíz, además de un juego haploide de 21 cromosomas de la avena. Se usaron análisis de marcadores ADN con RFLP para identificar los cromosomas de maíz presentes en las varias progenies de avena x maíz.
La selección asistida de marcadores (sigla en inglés: MAS) puede ser aplicada al genotipo en vez del fenotipo de las plantas. Dos ventajas teóricas del MAS, por lo tanto, son que puede ser aplicada en cualquier estado del desarrollo de la planta y que la selección del genotipo no es influenciada por el ambiente. Otra ventaja de la selección de genotipos con la MAS es que puede ser posible seleccionar genotipos con resistencia o tolerancia a estreses espe-cíficos en el laboratorio sin que sea necesario crear condiciones de estrés en los criaderos, lo cual además de ser caro puede ser poco confiable e impredecible. Hay algunos ejemplos de la aplicación de la MAS a carac-teres poligénicos en los que se ha informado de alguna respuesta positiva a la selección. Edwards (1992) y Stuber (1992, 1994b) revisaron los trabajos sobre la selección asistida de marcadores usando marcadores de isozimas y se ha informado que las MAS usando RFLP han sido efectivas para transmitir QTL para rendimiento de grano de híbridos a líneas endocriadas seleccionadas de maíz (Stuber, 1994a,b). Tanksley y Nelson (1996) usaron el análisis de retro-cruzamientos avanzados de QTL para la identificación y transferencia de QTL de valor de germoplasma extraño no adaptado a líneas endocriadas seleccionadas; tal procedimiento parece tener la ventaja de que los QTL extraños ya están incluidos casi totalmente en la constitución de las líneas endocriadas seleccionadas y, por lo tanto, son necesarias unas pocas genera-ciones para que puedan ser probados como productos potencialmente prontos parta el uso comercial. Algunos estudios comparativos empíricos de la MAS y de los métodos de mejoramiento convencionales han sido aplicados para caracteres poligénicos que involucran los QTL en el maíz (Edwards y Johnson, 1994; Strmberg, Dudley y Rufener, 1994). Ninguno de estos estudios mostró la superioridad de la MAS sobre las selecciones fenotípicas convencionales. Lee (1995) comentó que es probablemente prematuro extraer conclusiones definitivas sobre la eficacia y la eficiencia de la MAS.
En el caso del maíz, la tolerancia a la sequía y la resistencia a los insectos han llamado la atención de los investigadores por un largo tiempo. La selección para un intervalo reducido de antesis-emisión de los estambres (ASI) está correlacionada con la sequía y ha sido usada para la selección de rendimiento bajo condiciones de estrés (ver el Capítulo Estreses abióticos que afectan al maíz). Una selección eficiente para la tolerancia a la sequía requiere un manejo cuidadoso de las condiciones experimentales de las parcelas, lo cual no solo no es simple, sino que algunas veces es imposible de obtener. Los investigadores en el CIMMYT, en México, están trabajando sobre marcadores moleculares y han identificado segmentos de genomios o QTL, responsables por la expresión del ASI (Hoisington et al., 1996; Ribaut et al., 1996). Los resultados preliminares indican que las MAS basadas en el ASI en QTL podrían tener éxito para mejorar la tolerancia de las líneas endocriadas del maíz sin afectar mayormente las características agronómicas de las líneas estudiadas. Siguiendo la misma orientación, los QTL para resistencia/tolerancia de dos especies de barrenadores del maíz, el barrenador del sudoeste y el barrenador de la caña de azúcar, han sido identificados y están siendo estudiados para su efectividad en la MAS (Hoisington et al., 1996). Los resultados obtenidos hasta ahora sugieren que los marcadores pueden disectar caracteres com-plejos tales como la resistencia a los insectos y la tolerancia a la sequía. Los marcadores ligados pueden ser usados para transferir seg-mentos específicos de líneas resistentes a líneas susceptibles y los marcadores pueden permitir cambios seleccionados en alelos específicos en QTL para caracteres complejos en los programas de mejoramiento. Los marcadores del ADN tienen un uso definido y son útiles para la investigación básica. Es necesario continuar las investigaciones para determinar el uso mas apropiado de los marcadores moleculares en el mejoramiento del maíz y su utilidad práctica debe ser aún establecida y verificada.
Uno de los aspectos mas interesantes de la ingeniería genética y de la biotecnología es el desarrollo de las técnicas de transformación para la producción de plantas transgénicas, un aspecto del fitomejoramiento que ha llegado a la imaginación, la atención y la preocupación de los investigadores y también de los consumidores del nuevo producto. Hasta hace poco tiempo los esfuerzos del fitomejoramiento del maíz se limitaban a la utilización de la variabilidad genética encontrada en el genomio del maíz o en unas pocas especies emparen-tadas que se pudieran cruzar con el maíz; todas las transferencias de genes ocurrían a través del proceso de hibridación sexual. Ahora, la ingeniería genética ha proporcionado un mecanismo por el cuales genes extraños de especies y organismos que no tienen ninguna relación con el maíz, pueden ser introducidos en su genomio, eludiendo la ruta de la hibridación sexual. Los cultivos in vitro y la regeneración de plantas de maíz por medio del cultivo de tejidos y la introducción de genes extraños en las células cultivadas son los elementos básicos de esta tecnología. Los cultivos de cereales no son de fácil regenera-ción in vitro, como ocurre también con otros cultivos. Las técnicas para una regenera-ción exitosa de maíz in vitro están ahora dispo-nibles, como se mencionó anteriormente en este capítulo, por medio de la identificación de genotipos apropiados y una adecuada composición del medio de cultivo. Esto abrió grandes vías para las transformaciones del maíz.
Se han seguido tres enfoques para abrir el camino a la entrada de genes extraños en la planta de maíz. Estos son: el uso de protoplastos, el enfoque biolístico usando el bombardeo de los genes y la infección con Agrobacterium. Las plantas de maíz genética-mente transformadas fueron obtenidas de protoplastos de maíz tratados con ADN recombinante (Rhodes et al., 1988). Las plantas fueron regeneradas de líneas de células transformadas y cultivadas hasta su madurez. Al mismo tiempo, los investigadores en la Cornell University, Ithaca, New York, E. U. de América, utilizaban el bombardeo de los genes; desarrollaron una pistola que lanzaba minúsculas esferas de tungsteno que habían sido sumergidas y revestidas con el material genético a transferir. Estas esferas fueron inyectadas directamente en las células de la planta a ser transformada. Diversas varia-ciones de este enfoque fueron usadas en distintos laboratorios que desarrollan maíz transgénico. El CIMMYT en México ha estado trabajando en la transformación de líneas de maíz tropical y fue el primero que usó el enfoque biolístico con la ayuda de una pistola de genes que impulsó el polvo revestido de ADN en las células por medio del estallido de burbujas de gas a presión. La técnica del bombardeo de genes es poco refinada y no tiene control sobre el ADN que se introduce en el genomio de las células recipientes ni tampoco sobre el lugar donde el ADN extraño se localiza (Day, 1993). De cualquier manera, la técnica ha sido efectivamente usada para obtener plantas de maíz transformadas llevando el gen Bt de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis. En los cultivos de dicotiledóneas, se obtienen sin dificultad plantas transgénicas con el uso de Agrobacterium tumefasciens como vector para la transferencia de genes; esta es, sin duda, una técnica mas refinada que el enfoque biolístico usando el bombardeo de genes. Sin embargo, la técnica con el uso del Agrobac-terium no se puede usar en muchas gramíneas, incluso el maíz, ya que no son fácilmente susceptibles a la infección con esta bacteria. Recientemente, investigadores en Japón, han diseñado una técnica para transferencia de genes de maíz y otros cereales por medio de la infección con Agrobacterium (N. Bohorova, com. pers.). Esta técnica está siendo usada ahora en el CIMMYT para transformar el maíz y parece tener algunas ventajas claras; es mas eficiente para obtener inserciones estables de los genes extraños, permite la inserción de un gran número de genes y la técnica es mas simple de usar (CIMMYT, 1996).
Como se mencionó anteriormente, las transformaciones bien conocidas del maíz se basan en el gen Bt del Bacillus thuringiensis, una bacteria común del suelo que produce una serie de endotoxinas que son tóxicas para un gran número de insectos, incluyendo varios barrenadores del maíz (ver capítulos Mejoramiento para resistencia a los estreses abióticos y Mejoramiento para resistencia a las enfermedades). Estas toxinas son cono-cidas como proteínas Cry y están codificadas por el gen Bt presente en la bacteria; estas toxinas tienen un rango de toxicidad muy limitado y pueden ser dirigidas a insectos específicos. Muchos genes Cry han sido identificados y se ha definido su secuencia; el gen ha sido insertado en el genomio de maíz junto con la secuencia necesaria, modifica-dores, promotores, etc., y se expresa a través de la maquinaria normal de la síntesis de las proteínas de la planta (Hoisington, 1995). Los genotipos transformados de maíces templa-dos con el gen Bt fueron producidos usando el proceso biolístico (Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990; Genovesi et al., 1992; Koziel et al., 1993). La mayor parte de los trabajos de transformación de los maíces templados con Bt ha sido hecho por varias empresas privadas que han llevado a cabo las pruebas de campo del maíz transfor-mado (Hunter, 1993). Kozier et al., (1993) informaron que el maíz transgénico conteniendo el gen Cry1A(b) que es activo contra el barrenador europeo del maíz, mostró buena resistencia contra el mismo en los ensayos de campo.
El CIMMYT está usando genes Cry así como también otros genes dirigidos contra insectos para aumentar la resistencia del germoplasma del maíz tropical a los insectos mas importantes. Las líneas endocriadas de maíz tropical que pueden ser exitosamente regeneradas in vitro están siendo transfor-madas usando el método biolístico y por medio de la infección con Agrobacterium (CIMMYT, 1996). Una de las mayores preocupaciones existentes con los maíces transgénicos es que la resistencia puede ser basada en un solo gen extraño Bt y que tal resistencia puede desaparecer en cualquier momento o no durar mucho tiempo. Un enfoque mas válido es la combinación de la resistencia a los insectos desarrollada por medio de la selección recurrente en un programa convencional de mejoramiento y el uso de tales líneas para insertar fuentes adicionales de resistencia por medio del enfoque transgénico.
Las metodologías convencionales de fitomejoramiento han dado resultados positivos para mejorar la productividad del maíz y es de esperar que continúen haciéndolo en el futuro. Las nuevas herramientas de la biotecnología prometen buenos resultados, pero deben aún ser probadas adecuadamente y mostrar resultados prácticos. La tecnología convencional de mejoramiento del maíz ha permanecido prácticamente sin cambios en el último cuarto de siglo (Lee, 1995; Duvick, 1996a,b). Por otro lado, la tecnología del ADN ha cambiado muy rápidamente y continúa evolucionando. El fitomejoramiento es una inversión a largo plazo y el éxito de muchos programas de mejoramiento de maíz es el resultado de varias décadas de planificación y trabajo perseverante. El escepticismo de los fitomejoradores a las promesas de la nueva ciencia que es la biotecnología puede no siempre ser correcta, pero es sin duda alguna, comprensible. Para ello es necesario que los biotecnólogos desciendan del pedestal de las ciencias biotecnológicas mientras que los fitomejoradores deben salir de su mundo de éxitos. A diferencia de lo que ocurre actual-mente, donde los fitomejoradores y los biotecnólogos viven dentro de su propio campo de actividades, deben trabajar en equipo de modo que los nuevos conoci-mientos y la tecnología del ADN puedan ser combinados con el trabajo práctico de campo y llegar a mayores y mas rápidas ganancias en la productividad del maíz.
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1 El uso de "transposones" para adherir los genes y su uso en el mejoramiento para la resistencia a enfer-medades ha sido también discutido en el capítulo Citogenética del maíz tropical.
2 El ADN es una molécula gigante mucho mas grande que cualquier otra molécula celular. La información genética contenida en los genes de las plantas está almacenada en las secuencias del ADN en los cromosomas, o sea el genoma de la planta. El contenido de ADN por genoma de maíz es muy alto, mayor que el contenido de ADN en el genoma humano. Las plantas son capaces de replicar su ADN con gran seguridad y rapidez. Sin embargo, existen una serie de mecanismos que causan cambios en el ADN dando lugar a una gran variabilidad en el mismo, por lo que no es probable que dos plantas de maíz tengan una secuencia de ADN idéntica.
3 La técnica ha sido descripta con un lenguaje sencillo en la publicación Introduction to RFLP mapping and plant breeding applications preparada por Gary Kochert, Department of Botany, University of Georgia, Athens, GA, United States. Los protocolos de laboratorio para análisis de RFLP y RAPD fueron compilados en el CIMMYT por el Applied Molecular Genetics Laboratory, México.
4 El análisis mostró que un segmento del cromosoma 3 está duplicado en el brazo mas largo del cromosoma 10, lo cual apoya la hipótesis de que el maíz es un tetraploide.
