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Annexe A
Méthodes appliquées pour modifier les bactéries dans la panse

Bien que plusieurs groupes étudient déjà dans le monde entier la possibilité de modifier les bactéries dans la panse, la plupart des travaux de recherche en sont encore au stade préliminaire. On trouvera ci-après une description générale des méthodes appliquées.

Isolement des gènes codés pour les enzymes fibrolytiques

La méthode débute habituellement ainsi:

Pour l'étape suivante, il existe deux options:

Préparation de plasmides de bactéries anaérobies utilisables pour l'insertion de gènes

Un plasmide “navette” s'est révélé le vecteur le mieux approprié. Cela s'explique par le fait que la transformation des micro-organisms anaérobies de la panse risque d'être relativement peu efficace au stade initial, si bien qu'il peut se révélér indispensable de cultiver de grandes quantités de plasmides dans des bactéries E. coli. Le premier plasmide a été préparé par combinaison d'éléments d'un plasmide de Butyrivibrio avec des éléments d'un plasmide de E. coli (Gregg, K. et Ware, C., données inédites). Les aspects essentiels de cette opération sont les suivants:

Emplacement des facteurs de contrôle génomique situés en dehors des séquences de codage enzymatique

Il sera nécessaire à cette fin de soumettre les gènes clonés à des épreuves pour déterminer la neutralisation par des nutriments glucidiques simples. Quand cette caractéristique fait partie intégrante du gène enzymatique, des séquences de contrôle supplémentaires pourrant s'avérer nécessaires. Toutefois, il est possible que des fragments d'ADN distincts provenant du génome doneur originel soient nécessaires pour obtenir un système de contrôle viable. De plus, il est fort probable que le contrôle génomique puisse nécessiter l'action combinée de gènes multiples et il sera peut-être indispensable à ce stade d'utiliser des cosmides, eu égard à leur aptitude à accepter l'insertion de fragments d'ADN plus grands.

Intégration de gènes introduits dans le chromosome de la bactérie qui sert d'hôte

La méthode la plus probable est la suivante:

Transformation directe des bactéries anaérobies de la panse

On a déjà identifié des plasmides capables de réplication dans des micro-organismes anàrobies de la panse (Teather, 1982) et quelques plasmides de recombinaison ont été élaborés en vue de leur croissance dans des micro-organismes anaérobies du côlon humain (Smith, 1985).

Les problèmes à étudier sont les suivants:

Ces problèmes peuvent avoir pour résultat prévisible que la présence d'endonucléases de restriction non caractérisés aboutisse à réduire considérablement l'efficacité de transformation, encore que, une fois cultivé dans une espéce donnée, le plasmide sera protégé contre toute nouvelle transformation chez cette espéce. Si les plasmides disponibles sont dépourvus des caractéristiques nécessaires pour assurer le maintien des espéces dans la panse, cela aboutira à l'impossibilité totale pour le plasmide de se développer, ce qui pourrait nécessiter la recherche de plasmides naturellement présents dans les bactéries de la panse afin d'obtenir des séquences de contrôle de la réplication satisfaisantes.

Recherches nécessaires une fois créées des bactéries de recombinaison dans la panse

Compte tenu des progrès rapides de la génétique moléculaire, il y a tout lieu d'espérer que seront créées de nouvelles souches de micro-organismes de la panse douées d'une plus grande capacité de digérer les fibres (par fermentation). Les capacités requises ne sont pas parfaitement connues, mais il s'agirait d'obtenir des microbes ayant les caractéristiques suivantes:

La création de tels micro-organismes et leur croissance dans un milieu de culture ne devraient guère soulever de difficultés puisqu'on leur aura aussi conféré une résistance aux antibiotiques par clonage. Par contre, le maintien de ces micro-organismes dans la panse sera extrémement difficile en raison des mécanismes d'interaction et de compétition de l'écosystéme microbien complexe de la panse.

Des recherches très poussées sont nécessaires pour élaborer des techniques permettant d'examiner la niche écologique de ces micro-organismes, leur aptitude à survivre, les facteurs qui interviennent dans leur maintien dans la panse et leurs caractéristiques de croissance.

Il sera nécessaire de contrôles l'effectif de chaque espèce afin d'estimer sa représentation dans la biomasse de la panse et ses caractéristiques de croissance. Les microbes de la panse forment généralement deux grands réservoirs qui procédent à des échanges mais qui ne sont pas nécessairement dans un état d'équilibre (à savoir le réservoir libre dans le milieu liquide (le réservoir de colonisation) et le réservoir de microbes attachés aux particules (le réservoir séquestré)). C'est pourquoi il sera assez difficile d'estimer la contribution individuelle des différents micro-organismes.

Pour résoudre le problème, il faudra recourir à la technologie des isotopes associées au génie génétique. Au cours de travaux préliminaires effectués dans notre laboratoire, nous procédons au marquage de bactéries au N15, au S35, au C14 et au H3 à la fois in vivo et in vitro. Nous déterminons la relation spécifique radioactivitédurée des microbes “marqués” dans la panse afin de chiffrer le taux de croissance bactérien. Seules sont examinées à l'heure actuelle des populations mixtes de microorganismes de la panse, mais cette technologie conduira a la longue au marquage de micro-organismes individuels qui seront ensuite placés de nouveau dans la panse pour marquer le réservoir de ces micro-organismes. Pour suivre la dilution (le mélange et, par conséquent, la taille du réservoir et la croissance ultérieure du micro-organisme), il faudra recenser des espéces individuelles parmi les populations mixtes de microorganismes de la panse. On y parviendra en mettant au point des sondes d'ADN d'hybridation pour les différentes espéces individuelles de la panse.

Une fois vérifiés dans des conditions de laboratoire la croissance, le renouvellement et la capacité de survie des microbes de la panse, il faudra adapter la technique de laboratoire et la mettre à l'épreuve dans les conditions correspondant à celles qui régnent chez l'éleveur.


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