APLICACIONES DE LOS MARCADORES MICROSATÉLITES EN LA DOMESTICACIÓN Y CONSERVACIÓN DE ÁRBOLES FORESTALES¹

por

P. A. Butcher², J. C. Glaubitz y G. F. Moran
CSIRO Forestry and Forest Products
PO Box E4008, Kingston ACT 2604
Australia

INTRODUCCIÓN

Una información fidedigna sobre la distribución de la variación genética es un requisito previo para programar debidamente la selección, mejora genética y conservación de árboles forestales. La variación genética de una especie se determina, ya sea midiendo en el campo los caracteres morfológicos y métricos o estudiando en el laboratorio los marcadores moleculares. Las técnicas de laboratorio han dependido, hasta hace poco, de la estimación de la diversidad genética y el apareamiento de parámetros de sistemas procedentes de estudios de poblaciones mediante el uso de isozimas. Las isozimas continúan sirviendo como método relativamente sencillo y económico de obtener información genética, aunque su aplicación está limitada por el número de loci enzimáticos, sus bajos niveles de variabilidad en algunas especies y el hecho de que sólo revelan variación de los genes que codifican las proteínas. El desarrollo de los marcadores de ADN, incluyendo RAPDs (ADN Polimórfico Ampliado al Azar), RFLPs (Polimorfismo de longitud en fragmentos de restricción), AFLPs (Polimorfismo de longitud en fragmentos amplificados) y los microsatélites, han vencido las limitaciones sobre el número de loci variables y han servido como instrumentos para estudiar la variación en las regiones codificantes, no codificantes y altamente variables de los genomas, tanto nucleares como de orgánulos.

Los microsatélites son un tipo de marcador de ADN que está adquiriendo preponderancia en la definición de genotipos individuales y en los estudios del flujo de genes de árboles forestales. Los microsatélites o repeticiones de simple secuencia (SSRs), consisten en segmentos de ADN que contienen numerosas repeticiones en tandem de una secuencia de "tema" corto, normalmente de una a seis bases (p.ej. CACACACA�). Se ensayan mediante la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis y Faloona 1987), utilizando cebadores diseñados para acoplar las secuencias únicas que flanquean la repetición en tandem. El proceso PCR da lugar a un gran número de copias del segmento elegido de ADN que contiene la secuencia microsatélite.

La utilidad de los microsatélites se debe a su gran variabilidad, junto con la capacidad de hacer en forma semiautomática su análisis y clasificación. Los microsatélites son marcadores codominantes (los heterozigotos se pueden distinguir de los homozigotos) y por ello son mucho más informativos para definir genotipos individuales y poder realizar mapas de ligamiento, que los marcadores dominantes como los RAPDs y los AFLPs. Sin embargo, el número de secuencias de microsatélites en el genoma es limitado, lo que restringe su empleo para la elaboración de mapas genéticos cuando se compara con el número potencialmente ilimitado de loci correspondientes a los RFLPs, RAPDs y AFLPs. Otras limitaciones para su empleo son, en primer lugar, el esfuerzo y el gasto necesario para su desarrollo y en segundo término, la evidencia de que sus secuencias de flanqueo pueden no conservarse mucho a través de las especies de algunos géneros, por lo que los marcadores no son transferibles a especies no relacionadas directamente (Echt et al. 1996; Decroocq et al. 1997; Karhu et al., 1999). En estudios de poblaciones, la fuerte variabilidad detectada dentro de las mismas utilizando microsatélites, puede reducir de hecho su poder para detectar diferencias entre poblaciones. Por ello, se ha aconsejado tomar precauciones en la aplicación de métodos estadísticos, desarrollados para marcadores menos variables (p.ej. isozimas), con los datos de microsatélites (Hedrick 1999).

APLICACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES A LOS ÁRBOLES FORESTALES

Los primeros microsatélites desarrollados con árboles forestales fueron con el Pinus radiata (Smith y Devey 1994). Desde entonces se han desarrollado para genomas nucleares de una serie de árboles forestales de zonas templadas y tropicales (Cuadro 1). También se han aislado microsatélites procedentes del genoma de cloroplasto en varias especies de Pinus (Powell et al. 1995; Cato y Richardson 1996; Vendramin et al. 1996) y en el Abies alba (Vendramin y Ziegenhagen 1997). El genoma de cloroplasto se hereda por vía paterna en la mayoría de las gimnospermas, lo que ofrece oportunidades para estudios comparativos del flujo de genes por medio del polen -vs. semilla- y para ensayos de paternidad (Kent y Richardson, 1997).

Cuadro 1: Loci de microsatélites caracterizados en árboles forestales

Las principales áreas en que se están aplicando los marcadores microsatélites en árboles forestales incluyen estudios de diversidad genética en poblaciones naturales y mejoradas, particularmente en especies con bajos niveles de variación de isozimas, flujo de genes, dispersión de polen o semilla y sistemas de cruzamiento. Como estos parámetros son importantes para la conservación de los recursos genéticos forestales, los microsatélites se están utilizando para vigilar los efectos genéticos de los sistemas de ordenación forestal y de la fragmentación del bosque. En los programas de domesticación, pueden emplearse los microsatélites para la identificación del germoplasma y para ayudar a la construcción de mapas de ligamiento genético, con el objetivo final de lograr una selección asistida por marcadores.

DETERMINACIÓN DE GENOTIPOS UTILIZANDO MICROSATÉLITES (IDENTIFICACIÓN MEDIANTE EL ADN)

La mayor variabilidad de los microsatélites en comparación con las isozimas, aumenta la probabilidad de que cada individuo de una población tenga un genotipo único, lo que hace particularmente útiles los microsatélites para la identificación y seguimiento del flujo de polen o la dispersión de la semilla. Ello hace también que estos marcadores sean extraordinariamente sensibles a los cambios en la dimensión o estructura de la población que se mejora genéticamente y a los cambios de los niveles de dispersión (Slatkin 1995). En el árbol Pithecellobium elegans de la selva tropical, Chase et al. (1996a) pudieron distinguir el 80% de los individuos de una población utilizando únicamente tres loci de microsatélites en comparación con el 37% utilizando seis loci de isozimas. Había también un número mayor de alelos de los microsatélites que se limitaban al parecer a poblaciones únicas, aumentando el poder de detectar el flujo de genes entre poblaciones. Análogamente, en un estudio de 20 individuos sin ninguna conexión procedentes de cinco poblaciones naturales de Acacia mangium, la heterozigosidad esperada calculada a partir de cinco loci de microsatélites fue el triple que la estimada mediante RFLPs en los mismos individuos y 30 veces que la calculada por isozimas en un estudio previo de las poblaciones (Cuadro 2) (Decroocq et al. 1997). El setenta y cinco por ciento de los individuos se pudo distinguir con cinco loci de microsatélites y se detectaron alelos únicos en tres de las cinco poblaciones.

Cuadro 2: Comparación de los niveles de diversidad genética detectados en 20 individuos sin ninguna conexión de Acacia mangium, con diferentes marcadores

SEGUIMIENTO DE LOS PROGRAMAS DE MEJORA GENÉTICA

Estimación de los niveles de cruzamiento lejano en poblaciones naturales y de mejora genética: estudio de un caso de la Acacia mangium

La Acacia mangium es un árbol colonizador que se da naturalmente en Australia, Papua Nueva Guinea, Irian Jaya y las islas Molucas. Durante los últimos 20 años se ha convertido en la especie más extensamente plantada en el Sudeste de Asia para la producción de pulpa y papel. Su introducción en el sudeste de Asia como especie de plantación se cita con frecuencia como ejemplo de la disminución del rendimiento que puede producirse cuando tales introducciones están fundadas en una estrecha base genética (Simons 1992; Butcher et al. 1996). Se establecieron rodales de producción de semilla en Subanjeriji, Sumatra, que suministraron la mayoría del material de plantación para las plantaciones de Indonesia durante los años 80. Los rodales semilleros se establecieron a partir de poblaciones de la región de Daintree que están caracterizadas por unos niveles relativamente reducidos de diversidad genética (Butcher et al. 1998) y por unas bajas tasas de crecimiento (Harwood y Williams 1992) en comparación con las poblaciones procedentes del extremo septentrional de Queensland y Papua Nueva Guinea. En los ensayos de procedencias, una progenie de 30 meses de edad procedente de Subanjeriji produjo volúmenes de troncos que eran del 70 al 80% inferiores a los de la progenie de la procedencia de Nueva Guinea (Turvey 1995).

Para ayudar a explicar los malos resultados de las poblaciones de Subanjeriji y su fuente, se han utilizando marcadores microsatélites para examinar el sistema de mejora genética de las poblaciones naturales y los rodales semilleros. El polimorfismo incrementado en los loci de microsatélites da un mayor poder para detectar los casos de cruzamiento lejano. Se determinaron las tasas de cruzamiento lejano para las poblaciones procedentes de Daintree en Australia, Bimadebun en Nueva Guinea, y Aru en las Molucas y se compararon con el rodal semillero de Subanjeriji utilizando seis marcadores microsatélites. La población procedente de Daintree tenía unos niveles muy elevados de intracruzamiento (70%) lo que contrasta con las poblaciones procedentes de Nueva Guinea y Aru en las que no había pruebas de intracruzamiento. Las tasas de cruzamiento lejano en Subanjeriji eran las mismas que las correspondientes a las poblaciones de su fuente original en la región de Daintree, lo que sugiere que el intracruzamiento puede ser un factor que contribuye a sus malos resultados. Las diferencias entre las poblaciones de A. mangium tienen importantes consecuencias para los programas de mejora genética. Las predicciones sobre las ventajas genéticas procedentes de una selección recurrente en los huertos semilleros se basan en el supuesto de un apareamiento al azar; no obstante, si una alta proporción de la semilla se produce por autofecundación, las ventajas procedentes de la semilla de segunda generación serán muy inferiores a las esperadas. Además, el uso de un coeficiente constante de correlación para estimar la heredabilidad y la ventaja genética de los ensayos de procedencias y progenies conducirá a estimaciones sesgadas. Este ejemplo demuestra los problemas que pueden surgir cuando los programas de mejora genética se basan en una muestra limitada del ámbito geográfico de una especie y sin conocimientos del sistema de cruzamiento genético.

Gestión técnica de huertos semilleros

Los microsatélites se pueden emplear en la gestión técnica de huertos semilleros para estimar la contaminación de polen procedente de fuentes externas y también para estudiar los modelos de apareamiento y la variación de la fertilidad masculina. Tales estudios incluyen la determinación del parentesco masculino de la semilla producida en el huerto (el parentesco femenino es conocido). El poder discriminar entre los individuos masculinos es función del número de marcadores, de la cantidad de variabilidad alélica en loci individuales, la frecuencia de los alelos en la población y el número de individuos masculinos en la población.

En el caso de los robles (Quercus robur) se utilizaron microsatélites para determinar las relaciones genéticas entre árboles seleccionados (Lefort et al. 1998). Utilizando nueve loci se estableció que cinco árboles seleccionados no estaban estrechamente emparentados y podrían constituir por tanto una fuente de semilla adecuada para un programa avanzado de mejora genética. En un segundo estudio, se utilizaron nueve loci de microsatélites para detectar los contaminantes de la semilla y confirmar las relaciones de medio-hermanos en lotes de semilla procedentes de árboles individuales de Q. robur (Lexer et al. 1999).

Gestión técnica de programas avanzados de mejora genética

La identificación del germoplasma es un componente importante de los programas avanzados de mejora genética que dependen de cruces controlados o de la identificación correcta de los clones para los programas de propagación en masa. Se han detectado niveles importantes de error en pedigríes de cruces controlados utilizando marcadores microsatélites.

En el Pinus radiata se han empleado tres microsatélites para identificar debidamente individuos identificados incorrectamente en dos pedigríes de cruzamiento controlado que se plantaron en tres estaciones de ensayo en el sudeste de Australia. Un dos por ciento de la progenie estaba identificado incorrectamente en un pedigrí, mientras que en un segundo pedigrí el 20% de la progenie estaba identificado incorrectamente (J.C. Bell y G.F. Moran, CSIRO datos sin publicar). La mayoría de los fallos se encontraron en un solo ensayo, lo que indica que los errores se produjeron en la etapa de establecimiento del ensayo y no en la polinización. En pedigríes de Eucalyptus nitens, el momento en que se embolsaron las flores tras la polinización, tuvo un efecto importante en cuanto a la contaminación procedente de polen extraño. La tasa de error aumentó desde cero en un pedigrí en el que se dejaron las bolsas durante dos semanas después de la polinización, hasta el 20% en un segundo pedigrí en que se quitaron las bolsas una semana después de la polinización (M. Byrne y G.F. Moran, CSIRO datos sin publicar). Estos estudios demuestran que los marcadores microsatélites pueden no sólo emplearse para detectar errores en los pedigríes de mejora genética, sino que pueden también ayudar a identificar la causa de los errores. Podrían utilizarse también para reducir los niveles de error en los ensayos mediante la selección de las plantas antes del establecimiento de los ensayos.

ELABORACIÓN DE MAPAS GENÉTICOS Y CARACTERIZACIÓN DE LOS QTLs

Los mapas de estructura genética se pueden emplear para localizar los genes que afectan a rasgos de importancia económica o para estudios que comparen la organización de los cromosomas entre distintas especies. Para una selección inicial se pueden emplear marcadores moleculares de regiones cromosómicas que estén estrechamente asociadas con un rasgo cuantitativo. Los beneficios potenciales de la selección con ayuda de marcadores (MAS) son máximos para rasgos que son difíciles o costosos de medir (por ejemplo los rasgos de calidad de la madera y rendimiento en pulpa) y para rasgos que sólo se manifiestan bajo ciertas condiciones como por ejemplo la resistencia a una plaga o un patógeno determinado o a un factor abiótico, como la salinidad. La elaboración de mapas y la MAS tienden a utilizarse únicamente en especies de alto valor comercial y tienen el máximo potencial en programas clonales de mejora genética en los que se puede multiplicar cualquier ventaja adicional.

La gran variabilidad de los marcadores microsatélites, junto con la posibilidad de automatizar parcialmente el análisis y calificación de los loci que segregan, les hace teóricamente apropiados para la elaboración de mapas genéticos. Sin embargo, su aplicación en la elaboración de tales mapas en el caso de árboles forestales ha estado limitada por la disponibilidad de marcadores, a consecuencia del tiempo y esfuerzos necesarios para su desarrollo, junto con las limitaciones del número de secuencias de microsatélites en el genoma y de la posibilidad de transferir los marcadores entre distintas especies.

Se han situado microsatélites en mapas genéticos de Eucalyptus grandis x E. urophylla (19 loci), (Brondini et al. 1998), Pinus radiata (16 loci) y P. taeda (11 loci) (Devey et al. 1999), P. strobus (5 loci) (Echt y Nelson 1997), Quercus robur (18 loci) (Barrenche et al. 1998) y Acacia mangium (30 loci) (Butcher, datos sin publicar), en combinación con otros marcadores, por ejemplo RFLPs y RAPDs. Los datos procedentes de estos mapas indican que, además de ser generalmente más informativos que otros tipos de marcadores, los loci de microsatélites están dispersados por igual en todo el genoma.

CONSERVACIÓN DE RECURSOS GENÉTICOS DE ÁRBOLES FORESTALES

Mientras que el uso de los microsatélites para análisis de paternidad en estudios del sistema de apareamiento y para la elaboración de mapas genéticos, requiere pocos supuestos más allá de la herencia mendeliana, su interpretación en estudios de poblaciones y de carácter evolutivo requieren supuestos sobre la naturaleza y velocidad del proceso de mutación que generaron los diversos alelos (véanse las revisiones de Jarne y Lagoda, 1996; Goldstein y Pollack 1997; Nielsen y Palsboll 1999). La no amplificación de los alelos se ha registrado también a partir de datos de microsatélites, que se traducen en deficiencias aparentes de los heterozigotos y en coeficientes de intracruzamiento inesperadamente sesgados en estudios de poblaciones (por ejemplo White y Powell 1997a; Fisher et al. 1998; Thomas et al. 1999).

En un estudio comparativo de isozimas y microsatélites en robles (Quercus robur y Q. petraea), Streiff et al. (1998) encontraron que ambos marcadores revelaban análogas distribuciones espaciales en gran escala de diversidad. A pesar de la mayor variabilidad de los loci de microsatélites (como promedio A = 21,7 para microsatélites cf A = 4,3 para isozimas), se detectaron pocas pruebas de estructuración genética espacial en ambas especies, en concordancia con la evidencia del extenso flujo de polen a grandes distancias y procedentes de múltiples orígenes, como demuestran los análisis de paternidad (Streiff et al. 1999). Análogamente, en el caso de la Melaleuca alternifolia, un estudio de 500 individuos procedentes de poblaciones naturales utilizando 5 loci de microsatélites (Rossetto et al. 1999b) fracasó en la identificación de la estructura genética espacial más allá de lo que se había identificado previamente en 100 individuos utilizando 17 loci de isozimas (Butcher et al. 1992).

Los microsatélites pueden sin embargo proporcionar nuevas revelaciones sobre la estructura genética de poblaciones naturales y el flujo de genes en especies con poca o ninguna variación de alozimas. Empleando microsatélites procedentes del genoma de cloroplasto Echt et al. (1998) pudieron detectar la variación entre poblaciones de Pinus resinosa, una especie arbórea forestal con poca variación morfológica, sin variación de alozimas y una variación APAA limitada. El modelo de variación indicó poco flujo de genes entre poblaciones de P. resinosa que tienen una distribución discontinua. Poblaciones genéticamente distintas con altos niveles de variación de cloroplastos podían ser elegidas para la conservación de recursos genéticos de la especie y para programas de mejora genética. Con un muestreo adecuado, los marcadores de microsatélites de cloroplastos podrían emplearse para trazar las vías de migración tras el Pleistoceno y para identificar las poblaciones que son evolutivamente más divergentes (Echt et al. 1998). Sería interesante comprobar si tales poblaciones son también muy divergentes en sus genes nucleares, y en sus rasgos cuantitativos.

SEGUIMIENTO DE LOS EFECTOS DE LOS SISTEMAS DE ORDENACIÓN FORESTAL

Se han realizado varios estudios comparativos de microsatélites y otros marcadores nucleares que indican que los microsatélites son indicadores más sensibles de la estructura genética a escala más afinada. En un estudio de los efectos de los distintos sistemas de aprovechamiento sobre la diversidad genética del bosque de Eucalyptus sieberi del sudeste de Australia, Glaubitz et al. (1999) registraron distancias genéticas entre rodales próximos, estimadas mediante satélites que eran 9 veces superiores a los datos de los RFLPs. Los microsatélites ponían de manifiesto el doble de variabilidad que los RFLPs. La topología de un dendrograma basado en microsatélites debe ser por tanto menos sensible al error de muestreo debido a las distancias genéticas subyacentes muy superiores. En un estudio similar de Pinus contorta las distancias genéticas entre rodales sin aprovechar, plantados y regenerados naturalmente, eran sólo ligeramente superiores para los loci de microsatélites que para los loci de RAPDs (Thomas et al. 1999). Ambos estudios registraron diferencias nada significativas en los niveles de diversidad genética en rodales sin aprovechar en comparación con los de regeneración y ninguna diferencia entre las técnicas de regeneración.

SEGUIMIENTO DE LOS EFECTOS DE LA FRAGMENTACIÓN DEL BOSQUE

Los impactos de la fragmentación del bosque sobre la diversidad genética y sobre el flujo de genes se han examinado en varias especies utilizando microsatélites. En Pithecellobium elegans (Chase et al. 1996b) y Gliricidia sepium (Dawson et al. 1997) la evidencia a partir de los microsatélites sobre el flujo de polen entre árboles aislados en pastizales y fragmentos de bosque indican que tales árboles hacen una importante contribución a la diversidad genética del bosque contiguo no perturbado. En la P. elegans la mayoría de los casos de apareamiento no tenían lugar con los vecinos más próximos y el flujo de polen no disminuía por el aislamiento físico. En la Swietenia humilis, frondosa tropical, la comparación de los árboles de un pastizal aclarado con los de un bosque adyacente no perturbado, utilizando microsatélites, reveló niveles análogos de diversidad genética a pesar del menor número de alelos en los árboles del pastizal (White y Powell 1997a). La diferencia en el número de alelos podría ser reflejo del muestreo porque se muestrearon más del doble de árboles en el bosque no perturbado.

Estudios sobre el sistema de apareamiento y la dispersión de polen son sensibles a perturbaciones a corto plazo en el sistema de polinización, mientras que la diversidad de los árboles adultos puede dar una indicación más clara del potencial reproductivo dentro de los fragmentos de bosque. En el caso de la Symphonia globulifera se realizaron comparaciones entre las etapas de adultos, de brinzales mayores y menores, en los restos de una selva tropical y en un bosque continuo (Aldrich et al. 1998). La diversidad genética era superior en los brinzales mayores de las manchas de bosque remanente que en el bosque continuo adyacente, lo que se atribuyó a la concentración de semilla por los murciélagos que se alimentan de ellas. Sin embargo, resultó evidente el nivel superior de intracruzamiento en el bosque fragmentado y los brinzales procedentes de los restos de bosque se diferenciaban de los correspondientes al bosque continuo. Se llegó a la conclusión de que la reducción del número de adultos puede motivar cambios rápidos en la composición genética tras la fragmentación, particularmente cuando estos cambios se producen conjuntamente con la estructura genética preexistente.

Además de proporcionar datos sobre la estructura genética, a escala bien afinada, de poblaciones de árboles forestales, la mayor diversidad alélica de los microsatélites ha abierto posibilidades para el uso de métodos analíticos que permiten obtener deducciones más detalladas sobre los parámetros evolutivos y sobre los acontecimientos históricos (revisado por Luikart y England 1999). Se están desarrollando poderosos métodos que probablemente puedan estimar simultáneamente la fecha y el nivel aproximado de una reducción o incremento reciente en el tamaño efectivo de una población (N_e). Los ensayos de asignación estiman la dispersión entre poblaciones utilizando un método directo que se puede comparar con los métodos indirectos; la diferencia entre ambos indica en qué medida han tenido importancia acontecimientos raros e imprevisibles en la reciente historia de las especies (Slatkin 1987). Las estimaciones de las tasas de dispersión entre poblaciones son particularmente útiles para detectar la introgresión de genes procedentes de otras especies. La eficacia de estos métodos aumentará con el número y variabilidad de loci, haciendo posible la estimación de las tasas de dispersión entre poblaciones, la identificación de dispersores individuales y la reconstrucción de los linajes genéticos de las poblaciones naturales (Waser y Strobeck 1998).

CONCLUSIONES

Los marcadores microsatélites constituyen una poderosa herramienta para tratar cuestiones relacionadas con la mejora genética cuando es fundamental la distinción genética. En especies tales como el A. mangium y el P. resinosa con bajos niveles de diversidad de alozimas, estos marcadores pueden utilizarse para lograr más información sobre el nivel y distribución de variación y el sistema de mejora genética. Esto es particularmente importante para los programas de conservación, que pretenden conservar la mayor cantidad posible de diversidad con el fin de conseguir la viabilidad a largo plazo de las especies.

En programas avanzados de mejora genética, la mayor variabilidad de los marcadores microsatélites en comparación con las proteínas y otros marcadores de ADN mejora nuestra capacidad para distinguir entre individuos. Se puede determinar el parentesco de la progenie de un huerto semillero y se pueden verificar cruzamientos controlados. Los marcadores microsatélites han demostrado ser particularmente útiles para identificar errores y su probable origen en los programas de cruzamiento controlado. Se están utilizando para desarrollar mapas genéticos más completos. Tales mapas llevarán a un mayor conocimiento de la organización del genoma dentro de las especies y entre especies diferentes y probablemente de las bases genéticas de la variación cuantitativa.

La mayor variabilidad de los microsatélites ha llevado al desarrollo de procedimientos analíticos más potentes para asignar genotipos a las poblaciones de origen e identificar inmigrantes recientes dentro de las poblaciones. Este área de investigación tiene interés con la expansión de las plantaciones que utilizan germoplasma exótico con los consiguientes problemas referentes a la contaminación de los caudales genéticos locales. Sin embargo, las aplicaciones de los microsatélites en estudios evolutivos continúan siendo limitadas por cuestiones relacionadas con el modelo mutacional con que evolucionan. La precisión de las conclusiones realizadas a partir de datos de microsatélites en los estudios genéticos y evolutivos de las poblaciones, dependen de un modelo realista de la evolución molecular de estos loci.

AGRADECIMIENTOS

Charlie Bell y Chris Harwood hicieron valiosos comentarios sobre el manuscrito. Se agradece de modo especial el apoyo del Centro Australiano de Semillas Forestales, CSIRO.

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1. Recibido en agosto de 1999. Original en inglés.
2. Autor correspondiente P.A. Butcher. CSIRO Forestry and Forest Products, PO Box E4008, Kingston, ACT 2604. Tel.. +616 281 8289 Fax: +616 281 8233 Email: [email protected]