Nalda Romero
Fundamento
Se caracteriza por el uso de ebullición, ácido sulfúrico concentrado que efectúa la destrucción oxidativa de la materia orgánica de la muestra y la reducción del nitrógeno orgánico a amoníaco el amonio es retenido como bisulfato de amonio y puede ser determinado in situ o por destilación alcalina y titulación.
Dificultades químicas y prácticas
Digestión prolongada.
Conversión cuantitativa de nitrógeno a amoníaco.
Espumosidad excesiva.
Acción corrosiva de ácido sulfúrico sobre el sistema de extracción de humos.
Consideraciones ambientales respecto a descarga de humos y contaminación de aguas con catalizadores metálicos.
Soluciones
Aumentar relación sulfato de potasio/ácido
sulfúrico (1 g.1 m1) t° 370-410°C.
Uso de
catalizadores metálicos.
Uso de H2O2.
Catalizadores metálicos utilizados
a) Oxido de mercurio
Ventaja
Oprima recuperación de nitrógeno
Desventajas
Tóxico.
Alto costo.
Contaminación de aguas.
Formación de compuesto estable con amoníaco el que debe ser descompuesto con adición de tiosulfato de sodio.
b) Selenio o mezcla de sulfato de cobre y selenio
Desventaja
El selenio puede producir pérdida de nitrógeno.
c) Mezcla de sulfato de cobre y dióxido de titanio
Ventajas
Útil en análisis de cereales.
Uso a gran escala como rutina.
Desventaja
Menos efectiva en recuperar nitrógeno.
El amonio en el digestor puede ser determinado por diversos métodos:
Apropiado
para varios tipos
de productos.
Alta fiabilidad.
Usado como método de referencia.
Interfieren
compuestos nitrogenados no proteicos.
Uso de catalizadores tóxicos o caros.
Elección del factor de conversión.
2. Método de Dumas
Fundamento
Se caracteriza por pirólisis completa de la muestra y medición del contenido de nitrógeno de los gases de combustión.
El nitrógeno puede ser medido con manómetro después de absorber el dióxido de carbono en una solución alcalina o por conductividad térmica en métodos automatizados.
Ventaja
Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el método de Kjeldahl en análisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.
Desventajas
Incluye nitrógeno inorgánico.
Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y homogénea para minimizar el error de muestreo.
Este método no puede aplicarse a material húmedo por lo que debe efectuarse un secado previo.
3. Métodos radioquímicos
Se han descrito dos métodos:
a) Activación neutrónica
Fundamento
Se irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce el paso de l4N a 13N. Este positrón tiene una vida media de 10 minutos y emite radiaciones gamma las que se registran en un contador de centelleo . Las cuentas se relacionan con el contenido de nitrógeno de la muestra.
Ventajas
Simple; rápido.
Sin problemas de contaminación.
Los
valores encontrados presentan
buena correlación con el método de
Kjeldahl.
Desventaja
El costo de infraestructura es muy elevado.
b) Activación protónica
Fundamento
Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con protones y se efectúa la conversión de 14N a 14O, un isótopo que decae con la emisión de un protón y de radiaciones gamma las que son registradas y relacionadas con el contenido de nitrógeno de la muestra.
Existen diversos métodos alternativos para determinar proteínas:
1. Utilización del factor de conversión
a) Determinar el contenido de nitrógeno total y multiplicar por un factor de conversión de nitrógeno a proteína. Este factor se calculó considerando el porcentaje de nitrógeno que contiene la proteína en los alimentos.
Desventajas del uso del factor de conversión:
Para efectos de cálculo se considera el contenido de nitrógeno de la proteína principal y no de toda la mezcla.
La fracción analizada no necesariamente es proteína pura.
No se realizan correcciones de nitrógeno no proteico.
Se ha sugerido determinar el factor de conversión de nitrógeno a proteína utilizando la composición de aminoácidos del alimento a analizar, lo que se complica al combinar los alimentos, por lo cual se prefiere continuar con el uso de los factores tradicionales informando a su vez el factor utilizado.
b) Determinar el contenido de nitrógeno proteico y multiplicar por un factor de conversión de nitrógeno a proteína.
Se han utilizado diversos métodos para separar la proteína de compuestos nitrogenados no proteicos entre los que se señalan:
| - |
diálisis y ultrafiltración por membrana; |
| - |
coagulación por calor (no es efectivo para caseína y gelatina); |
| - | uso de agentes precipitantes como: ácido túngstico, ácido tricloroacético, hidróxido de cobre, óxido férrico, acetato de plomo, ácido fosfotúngstico, ácido metafosfórico, ácido tánico, ácido sulfosalicílico, etanol, mezcla cloroformo y octanol (8:1), mezcla fenol, ácido acético y agua (1:1:1). |
Desventajas
Diferencias en las fracciones proteicas obtenidas por los diversos métodos. Debe considerarse posibles retenciones sobre la proteína precipitada de pequeñas moléculas no proteicas por adsorción o intercambio iónico. Problemas relacionados con el uso del factor de conversión de nitrógeno a proteína.
Fundamento
Las proteínas presentan un amplio rango de comportamiento químico debido a la propiedad de los aminoácidos de tener diferentes tipos de grupos funcionales, a las reacciones químicas de estos grupos y a los enlaces peptídicos.
Consideraciones en la aplicación de los métodos químicos:
| - | Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos métodos empíricos e indirectos sean calibrados con el método de Kjeldahl; |
| - |
se espera una buena correlación entre estos dos tipos de determinación de proteína cuando la relación N no proteico/N proteico es baja y constante; y |
| - |
son satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayoría de los vegetales y mezclas de alimentos. |
a) Método de Biuret
Principio químico
La reacción se caracteriza por una coloración púrpura cuando los iones cúpricos son complejados por los enlaces peptídicos a pH alcalino. El matiz del color depende del tipo de proteína y su intensidad depende del contenido de proteína presente.
Reactivo utilizado
Solución alcalina conteniendo iones cúpricos complejados con tartrato de sodio y potasio.
Lectura
550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.
Desventaja
Se ha encontrado poca aplicación en análisis de alimentos debido a la presencia de interferentes como azúcares reductores que reducen el ion cúprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.
b) Método "dye-binding"
Principio químico
Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína, coloreado e insoluble producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a pH 2. El anión coloreado se une por asociaciones electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por ejemplo a los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos terminales. Además se producen atracciones intermoleculares por interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la mitad no iónica del anión y entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del anión en solución.
El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de proteína.
Lectura
A595nm
Consideraciones
El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura ideal que sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda sensibilidad.
Ventajas
Util
en análisis de rutina de muestras similares.
Económico y rápido.
Preciso como el método de Kjeldhal.
Usado como método de referencia.
Desventajas
Dificultad en encontrar tinturas puras.
Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricación a otro, por lo que se require la calibración del método con cada lote.
No es aplicable a alimentos que varíen su contenido en grupos aminos (proteólisis, pardeamiento).
c) Método de destilación alcalina
Fundamento
La hidrólisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amoníaco el cual es destilado y su valor es relacionado con el contenido de proteína.
Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible para una proteína dada.
d) Método de Lowry
Reactivo
Acido fosfomolíbdico-fosfotúngstico
Fundamento
Cuando se agrega reactivo de Folin a una proteína, ésta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidación de los aminoácidos tirosina, triptófano, cistina, cisterna e histidina.
Lectura
A750 nm
Ventajas
Alta sensibilidad y simple de operar.
Desventajas
La respuesta del
color varía de acuerdo al tipo de proteína.
La intensidad del
color no es estrictamente proporcional a
la concentración de
proteína.
Los iones potasio,
magnesio, EDTA e hidratos de carbono
interfieren en la reacción.
e) Método de titulación con formol
Fundamento
A la muestra neutralizada con álcali se le agrega formaldehido en exceso el cual reacciona con cada grupo básico de lisina y arginina. El exceso de formaldehido se neutraliza con un exceso de álcali estándar el cual se titula, y se relaciona con el contenido de proteína.
Desventaja
Su reproducibilidad es menor a la de otros métodos alternativos.
3. Métodos físicos
Consideraciones
Son más simples, rápidos y el costo por análisis es menor aunque el costo de los equipos es elevado. La exactitud de estos métodos se relaciona con las características del material a analizar. La concordancia con nitrógeno total depende de que el material no varíe de muestra en muestra.
a) Espectroscopía infrarroja
Fundamento
Se aprovecha la absorción del grupo amida del enlace peptídico a 6,46 Tm.
Ventajas
Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo.
Desventajas
Interferido
por agua.
Proceso
de calibración complejo.
b) Espectroscopía infrarroja reflectante
Fundamento
La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja (0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.
Consideración
Es necesaria la calibración contra un conjunto de muestras estadísticamente significativas, analizadas por métodos de referencia tradicionales.
Ventajas
Rápido, análisis de multicomponentes. Aplicable a materiales sólidos. Cuantifica proteína en presencia de agua.
Desventajas
Interfieren almidones y lípidos.
Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en las partículas.
Proceso de calibración complejo.
c) Espectrofotometría ultravioleta
Fundamento
Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm.
Ventajas
Rápido, no destructivo.
Util para monitorear eluentes en columnas cromatográficas.
Desventaja
Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).
d) Métodos refractométricos
Fundamento
Mide la refracción directa de la proteína en solución o el cambio de índice de rafracción causado por la remoción de la proteína de la solución.
e) Método turbidimétrico
Fundamento
Mide la reducción de la intensidad de la luz al pasar por una suspensión de partículas de proteínas. Este cambio se relaciona con el contenido de proteína.
f) Espectroscopía electrónica
Fundamento
Irradiación del material con rayos X y cuantificación de los fotoelectrones liberados característicos al átomo de N del grupo amida de la proteína.
Ventaja
Buena correlación
con contenido de N total.
Pueden determinarse
simultáneamente otros grupos de
interés (grupos sulfuras de aminoácidos).
g) Polarografia
Determina trazas de proteína.
Los aminoácidos constituyen la estructura primaria de la proteína y le confieren el valor nutricional a los alimentos.
Para el análisis de los aminoácidos es necesario romper los enlaces peptídicos de las proteínas por medio de hidrólisis que puede ser ácida, alcalina o enzimática. La hidrólisis ácida se realiza con ácido clorhídrico de concentración 6N. El reactivo debe ser puro y no debe dejar residuos por lo que se recomienda una hidrólisis en fase gaseosa. Para que la hidrólisis de las proteínas sea completa es necesario tener en cuenta factores como la razón ácido/proteínas, la temperatura y el tiempo de hidrólisis y evitar la presencia de oxígeno en el medio aplicando vacío y nitrógeno para minimizar la oxidación de los aminoácidos.
Consideraciones de la hidrólisis ácida
La hidrólisis ácida afecta la estructura de ciertos aminoácidos, como:
Para compensar las pérdidas producidas en los aminoácidos y además para cuantificar los aminoácidos presentes se puede adicionar a la muestra antes de la hidrólisis, una cantidad conocida de un estándar interno que puede ser el ácido 2-aminobutírico.
Los aminoácidos libres se derivatizan por métodos precolumna o postcolumna y se separan aplicando la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía líquida de alta resolución o la cromatografía gas-líquido.
Requisitos de una derivatización precolumna:
Condiciones de reacción suave y rápida.Que forme derivados estables y de respuesta lineal.
Que
los factores de respuesta sean similares para todos los aminoácidos.
Que sea reproducible.
Alta resolución de los derivados de aminoácidos.
Que
reaccione con aminoácidos primarios y secundarios.
