Delia Rodríguez Amaya
El análisis de carotenoides puede tomar, dependiendo del grado de información deseado, tres caminos: i) determinación solamente de las provitaminas A; ii) determinación de las provitaminas y de los principales carotenoides no provitamínicos A; y iii) determinación de la composición completa de los carotenoides. Considerando la gran dificultad asociada a la tercera opción y también debido a la importancia fisiológica recientemente reconocida para los carotenoides sin actividad provitamínica A, la segunda es probablemente la estrategia más correcta para la obtención de datos para tablas de composición de alimentos.
Independientemente del camino a seguirse, tres factores dificultan los análisis: i) el gran número de carotenoides naturales; ii) la variación cualitativa y cuantitativa en la composición de carotenoides en alimentos; y iii) el posible deterioro durante el análisis al tratarse de compuestos altamente insaturados (1-3).
Los errores típicos son: i) extracción incompleta; ii) pérdidas en la saponificación, lavadas y partición; iii) separación cromatográfica incompleta; iv) identificación errónea; v) errores en la cuantificación y cálculo; y vi) isomerización y oxidación durante el análisis.
Es imprescindible que se implanten en forma rigurosa las debidas precauciones para evitar la formación de artefactos y pérdidas cuantitativas durante el análisis. Entre éstas se destacan: i) ejecución de los análisis lo más rápido posible; ii) protección contra la luz; iii) no utilización de alta temperatura; iv) uso de solventes de grado analítico o destilados, libres de impurezas destructivas (por ejemplo, éter etílico y tetrahidrofurano libres de peróxidos, cloroformo libre de ácido); v) exclusión del oxígeno (por ejemplo, aplicación de vacío, atmósfera de N2 o argón); y vi) empleo de agentes antioxidantes y neutralizantes (4,5). Las muestras frescas, si son cortadas o picadas, deben ser inmediatamente extraídas para prevenir la oxidación enzimática.
Es bien sabido que la composición de los carotenoides varía en función de factores tales como el cultivar o la variedad, estado de maduración, clima, composición del suelo, parte de la planta utilizada, duración de la postcosecha, procesamiento y almacenamiento (6). Por lo tanto, el muestreo es de absoluta importancia y los resultados deben ser acompañados por informaciones adicionales (por ejemplo, especificando cultivar, estado de maduración, parte analizada, origen geográfico). Los errores en el muestreo pueden superar los del propio análisis.
El procedimiento general de los análisis consiste de: i) extracción; ii) partición con éter de petróleo o hexano; iii) saponificación; iv) concentración; v) separación cromato-gráfica; y vi) identificación y cuantificación. La partición puede ser eliminada en los métodos que emplean HPLC (cromatografía líquida de alta eficiencia). La saponificación se usa para remover clorofilas y lípidos indeseables y en hidrolizar hidroxicarotenoides esterificados con ácidos grasos, liberando los carotenoides. Sin embargo, esta etapa debe ser evitada siempre que sea posible, puesto que puede causar degradación y producir compuestos artificiales (7), además de prolongar el análisis.
Los carotenoides son normalmente extraídos con solventes orgánicos miscibles en agua como acetona, metanol o etanol, siendo el primero el más utilizado. Con la introducción de la HPLC en el análisis de carotenoides, el tetrahidrofurano está siendo muy utilizado. La muestra (cuya cantidad depende del contenido de carotenoides) es macerada con acetona fría en un homogenizador eléctrico (por ejemplo, "waring blendor") con vaso de vidrio o acero inoxidable, durante lo 2 minutos, seguido de un paso de filtración en embudo Büchner o de vidrio. Para aumentar la extractabilidad de algunos tejidos resistentes a la penetración del solvente, se coloca inicialmente la muestra finamente picada en el solvente por cerca de 20 minutos en la heladera. Otras muestras como la calabaza y el maíz pueden ser homogenizadas con pequeñas cantidades de agua antes de la extracción. Las muestras secas deben ser rehidratadas antes de ser extraídas. La extracción y filtración deben ser repetidas hasta que el residuo aparezca sin color (2 o 3 veces).
Los carotenoides son transferidos a éter de petróleo o hexano (a veces con éter etílico), preferencialmente de forma suave y gradual en un embudo de separación. Para evitar la formación de emulsión, la cual es difícil de deshacer y ocasiona pérdidas de carotenoides que pasan para la fase acuosa, se adiciona el extracto en varias porciones al éter de petróleo que se encuentra en el embudo. Después de cada incremento, se agrega agua contra la pared interna del embudo de tal forma que no haya agitación. Una vez separadas las fases, se descarta la inferior y se repite el proceso adicionando una nueva porción del extracto. Cuando todo el extracto se encuentra en el embudo, se lava otras cuatro o cinco veces con agua para retirar la acetona residual. La fase de éter de petróleo con los carotenoides es después secada con sulfato de sodio anhidro y concentrada en un rotavapor a menos de 35°C.
La mejor manera de efectuar la saponificación, cuando es necesaria, es adicionando a la solución de carotenoides en éter de petróleo, igual volumen de KOH metanólico al 10%. La reacción se realiza durante la noche, en la obscuridad y a temperatura ambiente. La solución de carotenoides es lavada cinco veces con agua en un embudo de separación para retirar el álcali y después secar con sulfato de sodio anhidro.
La cromatografía en capa delgada (TLC) ha sido muy útil en el análisis cualitativo, especialmente en el monitoreo de reacciones químicas. Sin embargo, esta técnica ha tenido poca aplicabilidad en análisis cuantitativos debido a la posibilidad de isomerización y degradación de los carotenoides en una superficie altamente expuesta. La cromatografía en fase de gas no es apropiada por causa de la termolabilidad y falta de volatilidad de los carotenoides. El método tradicional para separar estos compuestos es la cromatografía descendente en columna (flujo por gravedad auxiliado con trompa de vacío) llamada cromatografía en columna abierta (CCA). La separación es seguida visualmente.
Los adsorbentes (fase estacionaria) más comúnmente usados en CCA son el MgO:Hiflosupercel en varias proporciones y la alúmina neutra desactivada. La sílica no es recomendada porque su acidez inherente puede causar degradación o isomerización de los carotenoides. De las muchas combinaciones de solventes, las más comúnmente utilizadas en la elución son el éter de petróleo o hexano, con porcentajes crecientes de éter etílico y acetona.
Esta técnica (8,9) ha sido hasta ahora empleada en el laboratorio de la autora en Campinas para determinar la composición cuantitativa de carotenoides en alimentos brasileños. El concentrado de carotenoides es aplicado como una cobertura delgada al extremo superior de una columna de MgO: Hiflosupercel (1:1 o 1:2) previamente embebida en éter de petróleo. La columna es preparada con una columna de vidrio (2 d.i. x 20 cm) empacada con adsorbente hasta una altura de 10 cm según la AOAC(10). La cromatografía se desarrolla con los siguientes eluyentes: éter de petróleo, 1, 2 y 5% de éter etílico en éter de petróleo y después acetona en éter de petróleo, aumentando de 1% hasta 100%, si se hace necesario. La proporción de MgO:Hiflosupercel y los volúmenes y porcentajes de los solventes de elución son adaptados a la composición de carotenoides de la muestra. La separación completa de los carotenoides, especialmente los presentes en cantidades trazas, frecuentemente necesita de recromatografía en columnas de MgO:Hiflosupercel o alúmina de aquellas fracciones obtenidas de la primera columna.
La HPLC es la técnica preferida en la actualidad, especialmente en países desarrollados (11-14). La mayoría de los métodos utiliza HPLC de fase inversa con columna C18, en la cual las interacciones son suaves, por lo tanto evitando la degradación de los carotenoides durante la cromatografía. Las fases móbiles más comunes son las combinaciones de acetonitrilo, metanol, diclorometano, tetrahidrofurano, cloroformo y acetato de etilo. La elución ¿socrática es más simple, reproducible y rápida y es recomendada para la determinación de las provitaminas A o los carotenoides principales. Sin embargo, a pesar de las desventajas de ser más compleja y requerir el reequilibrio entre análisis, la elución con gradiente es necesaria para una separación más completa de los carotenoides. De hecho, a pesar de la amplia citación del gran poder de resolución de la HPLC, difícilmente una única separación es suficiente para resolver todos los carotenoides de una muestra alimenticia. También, para muestras de alimentos, es importante usar precolumnas de protección para prevenir la entrada de impurezas a la columna analítica y prolongar así su vida útil.
En CCA, la resolución y reproducibilidad de la separación depende de la habilidad y experiencia del analista, particularmente en su destreza en empacar la columna, ajustar los volúmenes y porcentajes de los solventes de elución y visualizar las bandas. Sin duda, la HPLC tiene mayor potencial de resolución y reproducibilidad. Sin embargo, las propiedades de las columnas para HPLC de diferentes fabricantes varían significativamente; de hecho, se han observado diferencias entre lotes de columnas del mismo fabricante o dentro de un mismo lote. El desempeño de la columna también puede cambiar de un análisis para otro y, más acentuadamente, de un día para otro, especialmente cuando existe oscilación de la temperatura.
Una identificación conclusiva es un requisito fundamental en la obtención de datos confiables. Desafortunadamente, al examinar la literatura del área de alimentos, se nota que este aspecto no ha recibido su debida atención. En algunos trabajos empleando HPLC, los picos de los cromatogramas son designados con nombres de carotenoides sin haber evidencias concretas de la identificación. Esto ha ocasionado que las autoridades mundiales en carotenoides establezcan criterios mínimos de identificación:
| - | espectro de absorción UV/visible de acuerdo con el cromóforo sugerido |
| - | propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes, preferencialmente Rf (TLC) y tR (HPLC), inclusive cocromatografía con patrón auténtico y |
| - | espectro de masa que confirme por lo menos la masa molecular. |
Datos cromatográficos (orden de elución de la columna, tR en HPLC, Rf en TLC) proporcionan las primeras indicaciones sobre la identidad, pero no deberían ser usados como único criterio. Los valores de Rf y tR son difícilmente reproducibles. La cocromatografía es prueba definitiva para excluir posibles identificaciones cuando el incógnito se separa de los patrones; pero no es conclusiva para una identificación positiva. El espectro visible permanece como el medio de diagnóstico más accesible al investigador. Las longitudes de onda de absorción máxima (λmax) y la forma del espectro son características del cromóforo de enlaces dobles conjugados (cadena poliénica) y ciertas otras propiedades estructurales (4, 15). No obstante, hay casos de carotenoides diferentes con el mismo cromóforo (por ejemplo β-caroteno y sus xantofilas β-criptoxantina y zeaxantina), los cuales no pueden ser distinguidos por el espectro de absorción. El tipo, localización y número de grupos funcionales en las xantofilas (carotenoides que contienen substituyentes oxigenados) pueden ser verificados con reacciones específicas para los grupos (4, 16, 17). Estas reacciones pueden ser ejecutadas rápidamente con pequeñas cantidades de los carotenoides desconocidos y monitoreadas por espectrometría UV/visible, TLC o HPLC. Las pruebas químicas más importantes son la reducción de aldehidos y cetocarotenoides con NaBH4 o LiAlH4, acetilación de grupos hidroxílicos primarios o secundarios con anhídrido acético, metilación de grupos hidroxílicos alílicos con metanol acidificado y rearreglo epóxidofuranoide catalizado por ácido. La espectrometría de masa por impacto de electrones suministra las masas moleculares y fragmentaciones típicas de ciertos grupos o ciertas características de los carotenoides. Esta técnica, sin embargo, no es accesible a la mayoría de los laboratorios. Carotenoides comunes, bien conocidos, pueden ser identificados concluyentemente mediante la combinación consciente de datos cromatográficos, espectros de absorción y reacciones químicas específicas (18).
La introducción del detector "photodiode array" en HPLC facilita la caracterización de los carotenoides ya que los espectros de absorción pueden ser obtenidos automáticamente "on line". Por otro lado, las mayores cantidades de carotenoides separados, obtenidas en CCA, permiten la aplicación de los varios medios de identificación mencionados.
En la CCA, la cuantifícación es relativamente fácil. Las fracciones colectadas (identificadas) son cuantificadas espectrofotométricamente, conforme la ley de Beer. Las concentraciones de los carotenoides son calculadas según la fórmula:
El énfasis primordial en la HPLC es la separación de los carotenoides. De entre numerosos trabajos sobre la aplicación de la HPLC en el análisis de carotenoides en alimentos, apenas algunos pocos incluyeron cuantificación. En los artículos de revisión o capítulos de libros, el espacio dedicado a la cuantifícación es notablemente reducido, desproporcionalmente a su importancia. A pesar de la frecuente afirmación de que HPLC es la técnica más exacta, sensible y reproducible para el análisis cuantitativo de carotenoides, en la práctica los datos reportados son inconsistentes (1, 21, 22). Es sorprendente que algunas veces los picos que aparecen como hombros de otros picos mayores o picos altamente sobrepuestos son cuantificados sin ningún comentario sobre la inexactitud de tal práctica.
La cuantificación en HPLC sería fácil si la normalización (porcentajes por áreas) pudiera ser utilizada. Datos obtenidos de esta manera pueden ser considerados solamente como estimativos ya que los carotenoides poseen diferentes coeficientes de absorción y máximos de absorción en longitudes de onda diferentes, además de la necesidad de conocer las concentraciones absolutas (peso de cada carotenoide por peso de la muestra) en alimentos. Para obtener las concentraciones de los carotenoides en alimentos se requiere calibración interna o externa. Las curvas de calibración son construidas con patrones cuyas concentraciones son determinadas espectrofotométricamente como fue descrito antes. La exactitud de los resultados obviamente depende de la pureza de los patrones y del grado de exactitud con que sus concentraciones son conocidas. Se conoce el caso de dos investigadores que demostraron una gran variación en la pureza de trans-β-caroteno adquirido comercialmente (23, 24), necesitándose de una purificación antes de su utilización. Además del β-caroteno, sólo el a-caroteno está comercialmente disponible. Los patrones para los otros carotenoides deben ser obtenidos de fuentes naturales, aislados y purificados por CCA, TLC y HPLC. Adicionalmente y a pesar de afirmarse lo contrario, los patrones sufren degradación después de abierto el recipiente sellado. Las soluciones patrón deben ser usadas recién preparadas, tener su concentración verificadas por espectrometría y su pureza por TLC o HPLC. Por lo tanto, el mayor problema de HPLC es la dificultad para obtener y preservar los patrones puros de carotenoides, especialmente para la calibración externa donde es necesario inyectar frecuentemente los patrones. Además, el alto costo del instrumento, columnas, solventes y los servicios de mantenimiento limita el uso de esta técnica en los países en desarrollo.
Comparaciones directas entre los métodos de CCA y HPLC mostraron que cualquiera de estas técnicas puede ser usada para la determinación de las provitaminas A o los principales carotenoides (25, 26). Para la determinación de la composición completa de los carotenoides, la HPLC posee la ventaja de una mayor resolución; sin embargo, problemas en la identificación y cuantificación pueden complicar los análisis. Típicamente, la composición en carotenoides de los alimentos está constituida por algunos pocos carotenoides principales (1 a 4) y muchos carotenoides en niveles de trazas. Son estos carotenoides minoritarios los que dificultan los análisis, sea por CCA o por HPLC.
En años recientes, hubo una preocupación sobre la necesidad o no de separar los isómeros cis (presentes en cantidades pequeñas) y trans de las provitaminas A, sabiendo que los isómeros cis tienen biopotencias más bajas que los carotenoides trans correspondientes. La presencia de provitaminas cis ya fue investigada en numerosas muestras en el Brasil (28-29). La separación de isómeros no se justifica en frutas in natura, pues las provitaminas cis no fueron detectadas o se encuentran en niveles muy bajos. Por otro lado, varias hortalizas, especialmente las verdes, y productos procesados, presentaron isómeros cis en concentraciones variadas y significativas, demostrándose así la importancia de la separación de esos isómeros. Sin embargo, esta separación torna el análisis todavía más complejo. Por lo tanto, antes de incluir estas sofisticaciones en los métodos oficiales, las bioactividades de las provitaminas A deben ser reevaluadas, utilizándose procedimentos más específicos, sensibles y apropiados para su extrapolación a la nutrición humana antes que al crecimiento de ratas.
Agradecimientos
La autora agradece a la FAPESP y el CNPq por el apoyo financiero, sin el cual no hubiera sido posible la experiencia propia de este campo.
