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Tatjana Stevanovic[1]
Les différents portions d'arbre synthétisent et accumulent une gamme des produits naturels dont une multitude reste toujours à découvrir. Au cours de derniers trente ans les scientifiques ont appris beaucoup sur l'élucidation de la structure des produits naturels. La compréhension des processus dans lesquels ces molécules sont impliquées in vitro et in vivo, ainsi que de leur application, reste cependant moins bonne.
Les constituants extractibles du bois, qui sont accessibles aux solvants organiques par définition, sont souvent associés avec la durabilité naturelle du bois et avec les mécanismes de protection générale des plantes. C'est surtout le cas avec les polyphénols. Certains extractibles ont dernièrement attiré une attention particulière dans les domaines de la santé humaine, à cause de leur propriétés biologiques multifonctionnelles, dont l'activité antioxydante, désactivation des espèces actives de l'oxygène, désactivation des radicaux libres, les activités contre le HIV et les tumeurs ainsi que l'inhibition de certains enzymes.
La recherche des molécules provenant de feuillus, dont les propriétés nutraceutiques et pharmaceutiques, était au centre de nos études récentes. Nous avons étudié la composition chimique de l'écorce, du bois et de feuillage du bouleau jaune(Betula alleghaniensis), l'arbre emblématique du Québec, en s'intéressant surtout pour les triterpènes et les polyphénols extractibles. Nous avons découvert, pour la première fois, le triterpène non-cyclique, le squalène, comme le constituant majeur des extraits du bois de bouleau jaune. Les procédés de l'extraction, de l'isolement et de caractérisation spectroscopique du squalène sont décrits, ainsi que les mesures du potentiel antioxydant des extraits du bois de bouleau jaune riches en squalène. L'identification des polyphénols dans ces extraits par la HPLC est aussi présenté. Les polyphénols contribuent au potentiel antioxydants des extraits riches en squalène et une application de ces extraits en tant que complément alimentaire constituent des onguents pour protection de la peau.
L'industrie du bois du Québec produit annuellement une quantité de 35000 tonnes de sciure et une quantité de 53000 tonnes d'écorce, tout deux des sous-produits de la transformation du bois de merisier (bouleau jaune). Ce dernier est un arbre très apprécié au Québec, si bien qu'il a été au cours des dernières années nommé arbre emblématique du Québec. Dans un effort pour bien valoriser et contribuer à une exploitation complète de cette ressource forestière valable nous avons effectué une étude détaillée des triterpènes dans les différents tissus du bouleau jaune (Betula alleghaniensis): dans l'écorce, dans le bois et dans le feuillage. Nos résultats à date ont révélé une concentration importante de squalène, un triterpène non-cyclique, dans le bois de bouleau jaune.
Dans une étude récente on a invoqué le potentiel du squalène pour la prévention du cancer de la peau (Owen et al., 2000) de par sa réactivité avec l'oxygène singulet, qui, produit par le rayonnement UV, est à la base de formation des radicaux libres. Le squalène est un constituant important des huiles d'olive, dont la consommation est régulière dans les pays Méditerranéens. L'huile d'olive extra vierge contient du squalène à raison d'environ 400-450 mg/100 g. L'huile d'olive raffinée en contient quelque 25 % de moins (Owen et al., 2000). Une étude récente démontre une incidence inférieure du cancer de sein en Grèce par rapport à l'Israël, malgré une plus grande consommation moyenne des graisses en Grèce. Il semblerait que ce soit la qualité des graisses qui compte, le régime quotidien des Grecs étant riche en huile d'olive plutôt qu'en l'huile des graines végétales comme c'est le cas en Israël (Owen et al., 2000).
Certaines études indiquent également que la prise alimentaire de squalène pourrait avoir des effets bénéfiques autres que en prévention du cancer. Kohno et son équipe ont observé que le squalène agit comme un très puissant piège à radicaux oxygène réactifs à la surface de la peau humaine (Kohno et al., 1995). Chez les animaux, le squalène paraît également jouer un rôle important dans la santé de l'œil, et en particulier sur les bâtonnets rétiniens (Fliesler, Keller, 1997). Par ailleurs, plusieurs équipes ont montré que la capacité d'excrétion de toxines tels que l'hexachlorobenzène ou la strychnine s'accroît chez les animaux auxquels on fournit un supplément du squalane, un dérivé hydrogéné du squalène (Kamimura et al., 1992; Richter et al., 1982), mais certains de ces effets ne se manifestent qu'à très hautes doses. Le squalène est actuellement largement utilisé comme complément nutritionnel ou en cosmétologie, comme en témoignent le grande nombre de firmes le commercialisant sous diverses formes (voir Sites Internet). Toutefois, dans les utilisations citées, le squalène provient de l'huile du foie de requin.
Nous proposons ici une nouvelle source de squalène: les résidus provenant de la transformation du bois de merisier: la sciure restant après le sciage et le bois de cœur restant après le déroulage du merisier dans la production de placage. Le squalène serait dans ce sens un nouveau produits forestier appliqué dans la nutraceutique.
Un exemple d'application d'un ester d'origine naturelle, extrait des arbres, membre de la famille des phytostérols, comme nutraceutique est celui de sitostanol, connu sous les termes commerciaux de Benecol/Phytrol/Reducol (site web). Entièrement dérivé de l'industrie des pâtes et papier (Tall oil, sous produit de mise en pâte kraft du bois mou), il est utilisé comme un additif à la margarine contribuant ainsi à diminuer le cholestérol sanguin. On parle d'un volume de production de 4000 tonnes dans un 'joint venture' en Colombie Britannique. Ces produits ont peu d'effets secondaires et on ne leur connaît pas de limite à la consommation.
On envisage une application comparable pour le squalène et les extraits du bois de bouleau jaune qui en sont riches. Dans certains extraits cette molécule est accompagnée par un nombre restreint d'autres produits. Nos résultats préliminaires indiquent qu'on peut extraire, isoler et purifier le squalène dont les quantités théoriquement disponibles dans la sciure produite annuellement au Québec sont de 500 tonnes ce qui se traduirait à une valeur de 29 millions de dollars canadiens par année. La sciure du bouleau jaune s'avère une source beaucoup plus facilement disponible que l'huile du foie de requin, actuellement la source principale du squalène trouvé sur le marché, et à l'incidence écologique beaucoup plus faible.
Extraire et quantifier le squalène dans le bois de bouleau jaune
Nos études préliminaires ont révélé une concentration élevée du squalène dans le bois du bouleau jaune. Elle se situe entre 0,3 % et 1,6 %, calculé sur la masse anhydre du bois, selon le solvant utilisé et les conditions d'extraction. En plus, le squalène est accompagné par un nombre restreint d'autres produits dans le bois de bouleau jaune ce qui rend son extraction et son isolement plus facile.
La concentration du squalène que nous avons déterminée dans le bois bouleau jaune dépasse les concentrations du squalène dans toutes les autres sources végétales du squalène, telles le bois de bouleau européen (Lindgren, 1965), de tilleul (Lindgren, Svahn, 1968) ou l'huile d'olive (Owen et al., 2000).
Le foie de requins des mers profondes est la source naturelle la plus riche du squalène. L'huile du foie, dont le pourcentage n'est pas mentionné, contient 45% de squalène (Bordier et al., 1996). La sciure du bouleau jaune s'avère une source beaucoup plus facilement disponible que l'huile de foie de requin et à l'incidence écologique plus faible.
Quantifier et identifier les polyphénols accompagnant le squalène dans les extraits
Étant donné que le squalène est accompagné par un nombre restreint de polyphénols et de triterpènes dans les extraits étudiés jusqu'à maintenant, il devient très important d'étudier ces produits avec plus de détails.
L'activité antioxydante des polyphénols est bien documentée. Nous avons réussi à identifier quelques-uns des polyphénols dans les extraits contenant le squalène comme le produit majeur. L'activité antioxydante importante des polyphénols accompagnant le squalène dans l'huile d'olive a été aussi déterminée (Owen et al., 2000). Il ne faut pas oublier que l'huile d'olive est elle même un produit forestier, en plus de provenir du bois d'un feuillus, l'olivier européen Olea europea! Nous avons par exemple identifié l'aldéhyde syringique dans l'extrait du bois du bouleau jaune contenant le squalène comme le constituant majeur, tandis que l'huile d'olive contient son analogue oxydé, l'acide syringique.
Le deuxième triterpène que nous avons réussi à identifier dans les extraits contenant le squalène en concentration environs 50% de l'extrait, est le méthyle bétulinate acétylé. Sa concentration représente la moitié de celle du squalène et une étude des propriétés de ce produit s'avère importante. Pour réaliser cet objectif, une isolation de ce produit par chromatographie liquide haute performance semi-préparative sera tentée en parallèle avec la synthèse organique de ce produit à partir d'un intermédiaire disponible sur le marché.
Déterminer les propriétés nutraceutiques et antioxydantes du squalène et des polyphénols des extraits du bois du bouleau jaune
Plusieurs méthodes de mesure de l'activité antioxydante seront utilisées. Une première méthode consiste en l'étude de l'inhibition de l'oxydation induite du linoléate de méthyle par les extraits et diverses molécules de référence. Dans une seconde méthode, on mesure la capacité d'une molécule ou d'un extrait de donner un atome d'hydrogène à un radical libre, le 2,2-diphényl-1-picryl hydrazyle (DPPH) (Diouf, Perrin, 2001).
Un partenaire industriel pour mise en échelle pilote l'application des résultats de notre recherche
L'industrie du bois produit des quantités énormes de sciure du bouleau jaune, dont une partie est dirigée vers la production des panneaux et une partie est brûlée pour la production d'énergie. Le bois de cœur restant après le déroulage est habituellement dirigé vers l'industrie des panneaux pour le convertir en forme des copeaux d'abord. Une extraction des copeaux de bouleau jaune avant la production des panneaux est envisageable également. Ces deux applications restent possibles même après l'extraction et l'isolation du squalène. On compte réaliser une mise en échelle pilote du projet de l'isolement et de purification du squalène provenant de la sciure de bouleau jaune à travers une collaboration avec la firme Kemestrie de Sherbrooke, Québec.
Les échantillons du bois sont obtenus de plusieurs localités du Québec: St-Félix d'Otis, Saguenay-Lac-St-Jean, Duchesnay et St-Damien de Bellechasse et de l 'industrie de sciage du Québec, AMBSQ (Association de manufacturiers du bois de sciage du Québec), la firme Giguère et Morin, St-Félix de Kingsey et de l'entrepreneur privé de La Scierie Laurentien, en s'assurant toutefois que les échantillons proviennent bel et bien du bouleau jaune. La firme Industries Manufacturières Mégantic, Lac Mégantic, nous a procuré le bois de cœur provenant du déroulage de merisier dans la production de placage.
Les extractions
Les extractions sont effectuées par la technique de Soxhlet et par sonde ultrasonique dans un effort d'améliorer le rendement du squalène et la sélectivité de l'extraction. Les différents temps à l'extraction sont comparés pour les deux méthodes, tandis que pour la sonde ultrasonique l'influence de fréquence du son (variable) est examiné comme un des paramètres de l'extraction. À cette fin nous avons appliqué une sonde tout récemment acquise au laboratoire (Processor, Ultrasonic, 750W, 115 V) sur les trois types d'échantillons. Les extractions de diverses portions dans le tronc sont comparées: le bois de cœur et le bois d'aubier du bouleau jaune. Les extractions sont également effectuées sur les mélanges de sciures de feuillus disponibles de l'industrie de sciage de Québec et sur les résidus de déroulage (bois de cœur). Nous avons utilisé les solvants organiques que nous avons identifiés dans nos recherches précédentes comme les plus efficaces pour l'extraction des triterpènes et les plus sélectifs pour le squalène (Stevanovic Janezic et al., 2002; Habiyaremiye et al., 2002).
Identifications des constituants des extraits
La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) est utilisée pour l'identification des constituants peu polaires et/ou de faible masse molaire des extraits. On utilise aussi la LC-MS pour analyser les constituants polyphénoliques de plus grande masse molaire qui se décomposent trop facilement dans les colonnes de chromatographie gazeuse. Les comparaisons avec les spectres des composés authentiques sont appliqués pour les identifications. Une référence récente sur l'analyse des extraits du feuillage du bouleau européen Betula verrucosa nous a servi comme source d'information sur le motif polyphénolique attendu (Julkunen - Tiitto, 1998).
Quantification et identification des polyphénols dans les extraits et dans le bois du bouleau jaune
Les polyphénols sont des constituants du bois dont les propriétés antioxydantes sont bien reconnues. Notre objectif est de quantifier les polyphénols à la fois dans le bois par des méthodes développée par Scalbert et collaborateurs (Scalbert et al, 1989) et dans les extraits enrichis en squalène obtenus par fractionnement des extraits bruts du bois. Les déterminations des polyphénols totaux, des tannins condensés et des tannins hydrolysables dans le bois du bouleau jaune et dans les extraits mentionnés sont effectués suivant des méthodes de Scalbert.
Les extraits du bois de bouleau jaune riche en squalène sont étudiés par les méthodes chromatographiques pour identifier les constituants accompagnant le squalène dans les extraits. Les constituants volatiles sont identifiés par le GC-MS, qui permet toutefois l'identification du squalène. Les analyses par LC-MS, en utilisant les colonnes plus polaires, sont effectués pour identifier les polyphénols majeurs présents dans les extraits.
Les polyphénols dans les extraits du bois de bouleau jaune et leur propriétés antioxydantes
Les tanins condensés sont présents dans le bois de bouleau jaune et certains polyphénols sont identifiés dans les extraits riches en squalène. Les tanins condensés sont des oligomères proanthocyanidines qui sont souvent accompagnés par des dimers et trimères. Les tanins hydrolysables, dont les ellagitanins sont particulièrement importants dans le cas du bouleau jaune suivant nos résultats préliminaires, sont également identifiés dans les extraits. Ces polyphénols ont des propriétés biologiques multifonctionnelles. Le potentiel antioxydant des tanins et des polyphénols qui sont reliés par leur structure est particulièrement prometteur pour la prévention de plusieurs types de cancer et les maladies reliées au vieillissement (Miyamoto et al., 1993). Les maladies citées impliquent l'endommagement des cellules par les espèces actives de l'oxygène et/ou par radicaux libres. Notre organisme est en permanence soumis à un stress oxydant associé au métabolisme de l'oxygène dans nos cellules. Ce métabolisme est utile pour la production d'énergie, la défense contre des microorganismes pathogènes ou la détoxification de molécules toxiques. Les espèces actives de l'oxygène moléculaire ont cependant des effets délétères sur les tissus et induisent une augmentation du risque de cancers, maladies cardiovasculaires, ostéoporose ou maladies inflammatoires. La consommation avec les aliments d'antioxydants tels que vitamines, terpènoïdes ou polyphénols contribue à limiter ce stress oxydant et probablement à réduire les risques de développer les pathologies mentionnées. C'est pourquoi on a fait la mesure des propriétés antioxydantes des extraits cherchés dans cette étude.
Nous avons déterminé les propriétés antioxydantes des extraits du bois de bouleau jaune ainsi que des composés isolés (que nous jugeons susceptibles d'avoir des propriétés antioxydantes). Les deux méthodes de mesure de l'activité antioxydante précitées ont été utilisées. Nous envisageons aussi la mise au point d'une méthodologie permettant de déterminer la capacité du squalène et des divers extraits à désactiver l'oxygène singulet.
L'isolement du squalène des extraits, évaluation de ses propriétés et retombées escomptées de la recherche
On a enrichi les fractions contenant le squalène par la chromatographie sur colonne. En suite on a procédé à une séparation du squalène par une méthode HPLC semi préparatoire. On a utilisé une colonne non polaire de type C-18, avec un système acétonitrile- eau (99%-1 %, v/v) comme éluant. Une fois isolé, le squalène est caractérisé par la méthode d'analyses spectrale RMN.
Avec une industrie (Kemestrie, Sherbrooke) on va ensuite développer la méthode pour isoler le squalène sur une échelle pilote.
Le méthyle bétulinate acétylé est le composé qui accompagne le squalène dans les extraits qui en sont riches. Nous allons tenter l'isolation de ce produit également pour examiner ses propriétés et/ou de le synthétiser à partir des intermédiaires disponibles sur le marché.
Les applications du squalène et des extraits qui en sont riches comme complément nutritionnel (nutraceutique, aliments fonctionnels) et dans les formulations pour la protection de la peau sont envisagées pour réaliser un placement des extraits du bouleau jaune sur le marché.
La forêt québécoise est à la base de l'économie des régions dont le développement a besoin de diversification, comme souligné récemment par le président du Regroupement des sociétés d'aménagement forestier du Québec (Rioux, 2002). Une nécessité d'adopter la stratégie de diversification comprend la mise en valeur d'un plus grand nombre de ressources de milieu forestier. En plus de diversifier l'activité économique autour de produit vedette qui est le bois on peut très bien diversifier les activités en produisant d'autres ressources que le bois. Pour l'année 2001, en forêt privée, la récolte du bois a généré des revenues aux propriétaires de 570 M $, la sylviculture 50 M$, la sève d'érable 100 M$, alors que la production agroforestière (bleuets, atocas, if du Canada, arbres de Noël etc) de 13 M $ (Roux, 2002).
La forêt reste l'assise fondamentale de l'économie des régions du Québec et c'est davantage dans l'innovation à l'intérieur du secteur forestier qu'on retrouve la plus grande force. À part de miser sur la seconde transformation et sur le développement de créneaux aux produits à valeur ajoutée, il faut surtout insister sur l'utilisation de l'ensemble des essences forestières. Dans ce contexte une valorisation des résidus de la transformation du bois de bouleau jaune par une extraction du squalène et réalisation d'un revenue estimée à 29 M$ par année contribue parfaitement bien à l'utilisation complète de cette essence de feuillus bien appréciée au Québec.
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| [1] Département des
sciences du bois et de la forêt, Université Laval, Pavillon
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