Por:
Juan Carlos Medina B
NUTEK S.A. de C.V.
Tehuacán, Pue. 75700 México
El desarrollo en producción logrado en las explotaciones acuicuolas ha llevado muchos beneficios económicos para determinados países, tal es el caso de Chile, sin embargo estos avances espectaculares son acompañados por el incremento en riesgos y problemas por enfermedades de los peces, que deben enfrentarse utilizando una amplia variedad de productos químicos y de drogas para combatir y controlar todos los patógenos responsables. Buscando ante todo reducir en todo lo posible las pérdidas económicas que trae consigo esta situación.
Cuando se utilizan antibioticos de manera indiscriminada en la piscicultura, o en cualquier explotación pecuaria, se corre el riesgo de causar transtornos tales como provocar efectos adversos, toxicidad por exceso de medicación, afectar el medio ambiente, provocar resistencia bacteriana por sumistrar dosificaciones incorrectas en cantidad y en tiempo de aplicación y un concepto muy importante que debemos tener en cuenta es no permitir la existencia de residuos de antibioticos en los tejidos de estos animales que se destinan a nutrición humana.
El proposito de este trabajo es mostrar la situación actual en cuanto a la metodología analítica para la cuantificación de residuos de antibioticos en peces.
De acuerdo con Bravo entre los antibioticos más utilizados en Chile destacan las quinolas de segunda o tercera generación, la oxitetraciclina y los nitrofuranos, sobre estas drogas se enfocaran los problemas en procedimientos analíticos.
La nitrofurazona y la furazolidona pertenecen a un grupo de antimicrobianos sintéticos, altamente efectivos, que se denominan nitrofuranos. Tienen como caracteristica estructural contar con un grupo nitro en la posición cinco del anillo de furano.
Los nitrofuranos se han utilizado en las industrias avícolas y porcícolas, tanto con fines terapeuticos y como promotores de crecimiento. Sin embargo, los residuos de nitrofuranos en alimentos destinados a consumo humano han despertado grandes preocupaciones debido a que han sido implicados como carcinogénicos y mutagénicos, Yndestad Magne (1990), y pueden causar reacciones alérgicas en individuos sensibles.
Recientemente la Food and Drug Administration (FDA) dictaminó la prohibición del uso de los nitrofuranos, ya sea por vía oral o parenteral en todos los animales que producen alimentos para consumo humano, Food Chemical News, 1992. La FDA también consideró como de alta prioridad la prevención de no permitir el uso, fuera de las especificaciones, de las preparaciones de nitrofuranos de aplicación topica todavía permitidos.
Las limitaciones en el uso de nitrofuranos varian de país en país, de modo tal que la FDA no permite el uso de ningún nitrofurano en acuacultura y ha reducido el límite de tolerancia a cero ppm (Schnick 1990).
La detección de nitrofuranos en tejidos de animales es difícil, debido a que estos compuestos rapidamente se metabolizan formando por consiguiente multiples metabolitos, esto está demostrado en algunas especies animales, como por ejemplo en el bagre, “catfish” (Vroomen et al., 1988; Vroomen et al., 1988a). La significación toxicológica de estos metabolitos es desconocida todavía, porque el metabolismo, disposición y eliminación de los nitrofuranos en especies acuicolas incluyendo el camarón no han sido estudiados hasta hoy en día.
Las dificultades analíticas para la determinación de furazolidona y nitrofurazona en camaron y probablemente en salmón son mayores que otras especies como el catfish, la razón como es de suponerse se atribuye a la presencia de los pigmentos que colorean los musculos, lo que obliga a efectuar procesos rigurosos de purificación y limpieza de los extractos.
Las quinolonas representadas por la flumequina, los ácidos nalidíxico, piromídico y oxonílico son drogas antibacterianas altamente efectivas utilizadas frecuentemente para combatir una amplia de enfermedades importantes que se presentan en peces confinados en explotaciones. Estas drogas se caracterizan por ser efectivas contra un número de bacterias gram negativas. La preocupación acerca de los residuos de estos compuestos en los tejidos grasos de los peces ha creado la necedidad de determinar su concentración.
Entre las drogas utilizadas para prevención y control de enfermedades de peces destaca la oxitetraciclina que se utiliza principalmente en el tratamiento de infecciones tales como la vibriosis y furunculosis. Sin embargo se han establecido periodos definidos para retirar estos medicamentos con el propósito de reducir su presencia en los tejidos grasos de algunas especies como los salmonidos, el catfish y las langostas, inclusive para estas especies se ha limitado su presencia, en tejidos no cocidos, a valores tan bajos como 0/1 μg/g (Code Fed. Regulat., 1988). Mientras que en otros países como Canada su uso en acuacultura está aprobado, sin embargo para el caso de los salmones, se debe retirar 40 días antes de la cosecha si la temperatura es superior a 10°C y 80 días antes si es menor a 10°C.
Tradicionalmente los residuos de antibioticos se han estimado por medio de ensayos microbiológicos. Debido a su alta sensibilidad carecen de la especificidad requerida para propositos de control. Recientemente, los métodos cromatográficos por HPLC tienden a tener mayor aceptación.
Cuando se trabaje con muestras de camarón congelado, retire las cabezas y la cubierta de quitina, mantenga el resto de la muestra frio y semicongelado en un vaso que se encuentre dentro de un baño de hielo hasta que se procese. Las muestras se manipulan cuando el resto del camarón cubierto está parcialmente descongelado, firme y frio al tacto, pero que se pueda cortar con un cuchillo. Se recomienda utilizar cuchillos de acero inoxidable con mangos de polietileno de alta densidad (catálogo No7339-00-900-9861, Federal Supply Service, General Service Administration, Washington, D.C. o similar) para cortar y picar la muestra, esto se realiza facilmente con muestras semicongeladas como se especificó.
Las muestras de pescado congelado se dejan a la temperatura ambiente hasta que el tejido se encuentra semicongelado. Coloque una porción de músculo en una mezcladora y licue por 3 minutos. Utilizando una espatula retire las porciones que se adhieren a las paredes del vaso y mueva hasta homogenizar, la muestra debe tener la consistencia de una pasta espesa y una apariencia homogenea.
La obtención de estándares de referencia no representa problema, generalmente se adquieren en los Estados Unidos, ya en agencias oficiales o bien con fabricantes de producto, en México su adquisión puede realizarse a través de COSUFAR, comite de substancias farmaceuticas de referencia. Sin embargo debemos considerar como problemático el hecho de la inestabilidad de los estándares de antibioticos una vez que se encuentran en solución. Como ejemplo se describen los procedimientos de preparación de algunos antibioticos.
Para obtener una solución de oxitetraciclina a una concentración de 1,000 μg/ml, se pesan 100 mg de clorhidrato de oxitetraciclina (en rigor contiene como oxitetraciclina base 895 μg/mg, Sigma Chemical Co., St. Louis MO o similar) y se disuelven en 100 ml de metanol, se puede almacenar a -8°C, sólo es estable por 2 semanas.
Pese 2.5 mg de nitrofurazona o furazolidona (U.S. Pharmacopoeia, Rockville, MD 20852) estándar de referencia, utilizando una microbalanza, y transfiera a un matráz volumétrico de 25 ml. A cada matráz adicione 5 ml de dimetilformamida y agite hasta disolución completa, afore con acetronitrilo. Los nitrofuranos son sensibles a la luz, evite su exposición. Almacene las soluciones en el refrigerador y desheche después de un semana.
Pese 10 mg de cada uno de estas quinolonas (ácido oxolínico, nalidíxico, piromídico y flumequina, Sigma Chemical Co., St. Louis MO o similar), utilice microbalanza y transfiera a matraces de 100 ml, uno para cada estándar, disuelva y diluya con acetonitrilo.
El hecho de que la metodología analítica para la cuantificación de residuos de antibioticos en peces se encuentre en una etapa muy acelerada de investigación hace que aún no existan procedimientos oficiales de análisis y sea necesario seguir realizando experimentaciones. A manera de ejemplo se mostrará la información presentada en el congreso internacional del AOAC realizado en julio de 1993 sobre la determinación de oxitetraciclina en salmón, determinación de nitrofurazona y furazolidona en camarón y determinación de flumequina y los ácidos nalidíxico, oxonílico y piromídico en catfish (Munns et al., 1993, Carigan et al., 1993b, Rupp et al., 1993).
Debido a la alta solubilidad de la oxitetraciclina en un medio ácido resulta lógico que la extracción se realice con una mezcla de 2 ml de diclorometano y 20 ml de ácido metafosfórico, el peso de muestra recomendado es de 5 g, utilizando un homogenizador a velocidad media, por 60 segundos, y después se coloca en un agitador horizontal por 10 minutos, se centrifuga, el extracto se transfiere a un matráz y se repite el procedimiento de extracción, por 2 veces mas con 20 y 10 ml de solución extractante. Los extractos combinados se evaporan hasta cerca de 2 ml, utilizando un evaporador rotatorio a 35°C. el contenido se transfiere a un matráz volumétrico de 5 ml. Se lava en matráz de evaporación con 2 ml de agua y se transfiere al matráz volumétrico.
La extracción del los nitrofuranos del músculo del camarón con acetonitrilo permite buenas recuperaciones y previene de la transportación de material indeseable. La eliminación de materia grasa se realiza por medio de un lavado con hexano, la columna de purificación en fase sólida permite obtener una solución que puede someterse a cromatografía, sin la presencia de compuestos que puedan interferir en la cuantificación.
Cuando se utiliza una atmósfera de nitrógeno en un evaporador rotatorio, es importante mantener la temperatura a menos de 45°C y también no permitir que al ocurrir la evaporación total queden expuestos, por que se producirian pérdidas. En los procedimientos de evaporación, limpieza a través de un cartucho en fase sólida y una filtración se logra la eliminación de los pigmentos que pudieran interferir en la determinación.
La extracción y purificación de extractos encierra todavía algunas dificultades, aunque se siguen evaluando diferentes columnas en fase sólida, de acuerdo con Mumz et al., 1993, el mejor procedimiento de limpieza se lleva a cabo utilizando un proceso de partición ácido-base.
El procedimiento de extracción de quinolonas implica la utilización de diferentes solventes orgánicos, separaciones por centrifugación, desengrasado, partición y en algunos casos separación por columnas de fase sólida. Estos procedimientos requieren una excelente manipulación para minimizar las pérdidas de estas quinolonas.
La tendencia actual es utilizar la separación cromatográfica en fase reversa y emplear la detección utilizando la fluorescencia, las quinolonas residuales se habían cuantificado a 260 nm como longitud de excitación, sin embargo al trabajar a longitudes de onda mayores tales como 325 nm, se eliminan substancias que pudieran causar confusión en la interpretación de los cromatogramas.
En cuanto a la oxitetraciclina Carigan et al., 1993 reportaron el uso del detector UV para la detección en tejidos del salmón, en este mismo año Carignan et al., reportó que utilizando un detector de fluorescencia es posible realizar simultaneamente la detección y la confirmación de este antibiótico.
La detección de nitrofurazona y furazolidona se realizan utilizando sistema UV.
Una de las caracteristicas principales de los sistemas de cromatografía de líquios de alta resolución es la cuantificación de cantidades traza, que son implosibles de analizar por otros métodos. Como una idea de los límites de detección con esta tecnología se presenta la siguiente información:
| Nitrofurazona y furazolidona | 10 ng de droga/g de tejido |
| Oxitetraciclina | 50 ng/g |
| Quinolas | 10–20 ng/g. |
La tendencia a regular los niveles de residuos de antibioticos en tejidos de animales destinados a nutrición humana ha despertado mucho interes en la industría pecuaria, no pudiendo quedar ajena la industría acuícola.
La cromatografía de líquidos como técnica analítica es la de elección por su especificidad y sensibilidad, sobretodo cuando se trabaja con detectores de fluorescencia.
Aún no existen métodos oficiales y este proceso se encuentra en pleno desarrollo, sin embargo durante 1993 se ha presentado mucha información que nos indica hacia adonde apuntan las investigaciones.
Anonymous. Food Chemical News 35 (4), 12. 1992.
Bravo, Sandra. Revisión de los medicamentos utilizados para el control de las enfermedades de peces en Chile. Veterquímica.
Carignan, G., Carrier, K. and Sved, S. Assay of oxytetracycline residues in salmon muscle by liquid chromatography with ultraviolet detection. J. AOAC International, 76: 325, 1993.
Carignan, G., Carrier, K., Lessard, M. and Vilim, A. Simultaneous determination and confirmation of oxytetracycline in salmon muscle by HPLC with fluorescence detection. Program and Abstracts the 107th Annual AOAC international Meeting and Exposition, 1993.
Munns, R. K., Turnipseed, S B., Pfenning, A.P., Plakas, S.M., Roybal, J.E., Holland, D.C. and Long, A.R. Determination of flumequine, nalidixic, oxolinic and piromidic acid residues in catfish by HPLC fluorescence/UV detection. Program and Abstracts the 107th Annual AOAC International Meeting and Exposition, 1993.
Rupp, H.S., Munns, R.K. and Long, A.R. Simultaneous determination of Nitrofurazone and Furazolidone in Shrimp (Penaeus vannamei) Muscle Tissue by Liquid Chromatography with UV detection. Program and Abstracts the 107th Annual AOAC International Meeting and Exposition, 1993.
United States Pharmacopeial Convention, Inc.: Official Reference Standards, June 10, 1993.
Yndestas Magne. Public Health Aspects of Residues in Animal Products: Fundamental Considerations. Paper from Department of Food Hygiene Norwegian College of Veterinary Medicine, P.O. Box 8146 Dep. 0033, Oslo 1 Norway, 1990.
