El análisis de los especímenes y el examen histológico del material preparado deberá realizarse solamente sobre ejemplares recientemente muertos. Esto es de suma importancia para la detección de muchos protozoarios.
La secuencia del examen es según Bullock 1978.
Haga un raspaje de piel, monte en un portaobjeto con agua o solución salina y examine en busca de protozoos y monogeneas pequeñas. Examine la superficie exterior, incluyendo las cavidades bucales y operculares, en busca de parásitos externos grandes.
Retire las branquias y examínelas individualmente bajo agua.
Retire los ojos y ábralos bajo agua; examine lentes, humor y retina.
Examine la cavidad corporal. Saque una o dos gotas de sangre del corazón y examínelas en un portaobjetos. Haga frotis teñidos.
Retire el intestino, el hígado y la vesícula biliar. Examine el contenido de la vesícula biliar en un portaobjetos. Corte el hígado, aplaste una porción y examínela.
Examine el exterior del intestino y córtelo en secciones. Abra cada sección desde la parte posterior y obsérvela bajo agua in situ por si existieran parásitos. Haga un frotis del contenido intestinal y examínelo.
Corte las gónadas y haga preparaciones aplastadas en un portaobjetos.
Abra la vejiga natatoria y examine contenido y paredes.
Retire la vejiga urinaria y examine contenidos en un portaobjetos. Abra la vejiga bajo agua y examínela.
Corte los riñones y haga preparaciones aplastadas.
Examine la musculatura. Prepare porciones aplastadas por si existieran protozoos. Corte la musculatura en porciones delgadas. Métodos especiales para la detección de larvas de helmintos incluyen:
Prueba al trasluz: se examina la musculatura a través de una pantalla de vidrio esmerilado iluminado desde atrás con luz fluorescente.
Digestión de la musculatura utilizando una mezcla de pepsina/ácido clorhídrico a 37–50°C.
Saque el cerebro y examínelo. Prepare porciones aplastadas.
(Impreso para los resultados de disecciones de peces).
En este examen se siguió el método Bullock 1978.
La observación de parásitos, y a menudo su identificación, puede realizarse en agua o solución salina.
Los Mixosporidios coelozoicos pueden encontrarse examinando preparaciones aplastadas húmedas de la vesícula biliar, vejiga urinaria, ureteres y riñon. La mayoría de los Mixosporidios histozoicos, excluyendo la Myxosomas cerebralis, se encuentran en quistes blancos que pueden observarse a simple vista o con un microscopio de disección con diez aumentos. La presencia de la vacuola de glucógeno es importante en la identificación, y la dilución Lugol es a menudo inadecuada para este propósito debido a que algunas vacuolas yodofilas sobreviven el almacenamiento, mientras que otras no.
Para poder realizar un diagnóstico crítico se necesita conocer la envoltura mucosa de las esporas frescas, el tamaño de las esporas, la morfología y el tamaño de la cápsula polar, el grosor de la válvula y la morfología del esporoblasto, para lo cual se utiliza el método de la tinta de Lom.
Solución de yodo parasitológico:
10 g yoduro de Potasio
5 g yodo
100 ml H2O
Disolver el yodo en una pequeña cantidad de agua y yoduro de potasio antes de agregar toda el agua.
Tinta India de Lom:
1 parte de tinta India
4 partes de suspensión de esporas
Con respecto a los Trematodes Monogenea, Bauer et al (1973) recomiendan el examen en preparaciones temporales. Los ganchos de fijación y el órgano copulador se pueden reconocer mejor en especímenes vivos.
Se empleó el método de Bauer et al 1973.
Para la fijación de protozoos se pueden utilizar varios medios, algunos de los cuales se describen a continuación.
Con líquido de Schaudinn
Esparza el mucus donde están contenidos los parásitos en una capa fina sobre el portaobjeto. Luego coloque el portaobjeto con el material hacia abajo en una jarra con líquido de Schaudinn (ver Ap. 1) por un período de 15 a 20 minutos, lavándolo entonces con etanol 70°. Luego transfiéralo a una solución de yodo etanol 70° (la solución deberá tener color té fuerte). El yodo remueve el cloruro de mercurio. Manténgalo en dicha solución hasta que quede de color marrón. Entonces lávelo con alcohol 70° hasta su completa decoloración y guárdelo en un envase de portabojetos. Para prevenir que los portaobjetos se toquen entre sí, se colocan aros de papel grueso entre ellos para separarlos. El diámetro interior de estos aros deberá dejar libre el frotis. Finalmente, etiquete los portaobjetos y tíñalos con hematoxilina de hierro (ver Ap. I).
Impregnación con plata según el método de Klein
Este método es especialmente útil para Trichodina. Coloque el mucus en un cubre-objetos, séquelo y sumérjalo en una solución de nitrato de plata al 2% (AgNO3). Lávelo con agua destilada y expóngalo a la luz hasta que oscurezca. En luz difusa necesitará de 4 a 10 horas y al sol de 30 a 60 minutos. Lávelo, séquelo y colóquelo en bálsamo. Las esporas de mixosporidios se colocan en glicerol-gelatina o en picrato de amonio. (ver Trematodes Monogénea).
Seque las muestras de sangre, fijelas por 5 minutos en metanol sin agua y tíñalas con GIEMSA (ver Ap. II)
Se utilizó el método de Healy et al, 1978.
La mayoría de los Nematodos puede fijarse en alcohol 70° caliente o en alcohol acético (1 parte de ácido acético y 3 partes de alcohol 95°). Los Nematodos se almacenan en alcohol 70°. Se agregan unas pocas gotas de glicerina a fin de impedir la desecación en caso de evaporarse el alcohol durante ese tiempo.
Los adultos y larvas de 2–3 mm o menos se fijan mejor usando una solución de ácido acético al 0,5%. Se utiliza una mezcla de 4% de formol y 1% o 0,5% de ácido acético para la fijación y almacenamiento.
Los Nematodos se pueden aclarar en glicerina, alcoholfenol o en lactofenol. Luego, y antes de colocarlos nuevamente en la solución de preservación se lavan en alcohol 70°.
| Alcohol-fenol: | 80 partes de cristales de fenol fundido y 20 partes de alcohol absoluto |
| Lactofenol: | 20 partes de agua destilada, |
| 40 partes de glicerina, | |
| 20 partes de ácido láctico y | |
| 20 partes de cristales de fenol fundido. |
Se los libera del mucus tanto como sea posible. Los especímenes grandes se fijan como los Trematodos Digenéticos y los Céstodos (ver punto 2.3.4).
Los especímenes pequeños pueden colocarse en distintos medios: Bullock (1978 prefiere jalea de glicerina, mientras que Bauer et al (1973) prefiere la utilización de preparaciones de glicerina-gelatina (ver Ap. III) o una mezcla de glicerina y solución saturada de picrato de amonio al 1:1 (1 g en 100 ml de agua). Estas preparaciones deberán mantenerse con bálsamo, barniz de asfalto, laca de uñas o cera de colofonio.
Los Digenea y Acantocéfalos deben dejarse en reposo en agua de canilla o mejor aún en agua destilada. Los Acantocéfalos deben tener la proboscide completamente extendida de tal manera que se pueda observar. También debe estar limpia de mucus antes de la fijación, si es que se requiere la identificación de la especie. Los especímenes de los tres grupos se fijan entre dos portaobjetos, y si fuera necesario, se coloca una pesa. El agente de fijación puede ser introducido por el extremo del portaobjeto.
Bullock (1978) recomienda utilizar formol neutro caliente (4%) para la fijación, luego de 24 horas se lavan en agua destilada y se almacenan en alcohol 70°. Bauer et al (1973) recomiendan la utilización de alcohol 70°. Los especímenes que van a ser seccionados para investigación histológica pueden fijarse con el líquido de Bouin.
Se siguió el método de Richardson 1975.
Se las narcotiza en una solución de eter 4% en agua. Esta narcotización es rápida, ocurriendo la muerte entre dos y cinco horas, dependiendo de la temperatura y el tamaño del individuo.
Deberá removerse el mucus del especimen muerto, luego se extiende derecho sobre papel de filtro húmedo y se cubre con papel de filtro apenas mojado con formol 5°. Se deja endurecer por 12 horas y luego se les conserva en formol 5°.
Se fijan y almacenan en alcohol 70° (Bullock 1978, Bauer et al 1973).
El estudio sobre agentes de fijación se basa en Bullock 1978.
Probablemente, el más ampliamente utilizado es el formol. Se obtiene en forma concentrada de 40% por peso. Su mayor desventaja como agente de fijación es la irritación que provoca en el sistema respiratorio y en los ojos del manipulador; además, sintetiza la piel produciendo “dermatitis por formol”. El formol comercial tiene una acidez de 3–5, por lo tanto, se deberá tener cuidado en verificar el pH final de cualquier agente de fijación basado en formol.
100 ml formol 40°
200 ml agua canilla o destilada
4 g NaH2PO4-H2O
6 g Na2HPO4
La mayoría de los tejidos pueden ser fijados en forma adecuada en un período de 8 a 24 horas para diagnóstico rutinario; si se desea obtener preparaciones óptimas, deberá emplearse un tiempo de fijación considerablemente más largo.
45 g cloruro de mercurio
5 g cloruro de sodio
20 g ácido tricloroacético
40 ml ácido acético
100 ml formol
800 ml agua destilada
Probablemente, el Susa es el mejor agente disponible para una fijación rápida de pequeñas porciones de tejido. El cloruro de mercurio precipita las proteínas, las que rápidamente son penetradas y se endurecen. La tasa de penetración decrece luego de 2–3 min, por lo que los bloques de tejido no deberán exceder los 5 mm3; con más de 5 mm3 van a quedar sobrefijados en la periferia e inadecuadamente fijados en el centro.
El especimen deberá ser transferido a alcohol 95° para su procesamiento ya que la inmersión en solución acuosa resulta en un excesivo entumesimiento de cualquier tejido conjuntivo presente. El cloruro de mercurio deberá ser retirado antes de la tinción incorporando los bloques o las secciones en una solución de 0,5% de yodo en alcohol 80°.
Como desventaja puede mencionarse que el cloruro de mercurio es altamente tóxico y corrosivo; deberá tenerse cuidado al emplearlo. No deberá almacenarse en envases de metal o con tapa de metal. Además, es una solución de alto costo, como para usarla en forma rutinaria.
75 ml ácido pícrico acuoso saturado
25 ml formol
5 ml ácido acético
Penetra rápidamente con poca pérdida o deformación, produce una rotura parcial de las células sanguíneas y tiene un efecto entumecente en las fibras de colágeno.
Las porciones pequeñas de tejidos, 2–3 mm de grosor, se fijan en 2–3 horas; las porciones más grandes requieren hasta 24 horas.
El ácido pícrico precipita las proteínas y se combina con ellas para formar picratos; algunos de ellos son solubles en agua, de forma que el material fijado deberá ser transferido directamente a alcohol a fin de prevenir la disolución de estos picratos. El líquido de Bouin no es recomendable para preparaciones de piel ya que hace mucho más difícil el corte de escamas y el entumecimiento es extremo.
60 ml alcohol absoluto
30 ml cloroformo
10 ml ácido acético
Probablemente, este líquido es el que penetra más rápidamente en los tejidos, pero causa una considerable contracción de los mismos y se destruyen muchos componentes del citoplasma. Se puede reducir en algo dicha contracción realizando la fijación a 0°C. La fijación de una porción de 5 mm de espesor generalmente se completa en un período de 1–2 horas, y para especímenes pequeños, unos 15 min son suficientes.
Los siguientes dos agentes se utilizan para la fijación de bilis, pituitaria y material pancreático.
Líquido de Zenker
5 g cloruro de mercurio
2,5 g dicromato de potasio
1 g sulfato de sodio
150 ml agua destilada
5 ml ácido acético glacial (agregarlo inmediatamente antes de usar)
Líquido de Helly (Zenker-formol)
5 g cloruro de mercurio
2,5 g dicromato de potasio
1 g sulfato de sodio
100 ml agua destilada
5 ml formol (concentrado) (agregarlo inmediatamente antes de usar)
Para ambas fijaciones es necesario lavar el tejido durante 12–24 horas antes del proceso.
80 ml ácido pícrico, solución saturada en 35% de alcohol
15 ml formol (concentrado)
5 ml ácido acético glacial
Este agente resulta particularmente útil para la demostración de glucógeno.
Estas técnicas de decalcificación se basan en Bullock 1978. No son utilizadas frecuentemente en laboratorio, pero aún así deben ser mencionadas.
El objetivo de la decalcificación es remover los iones de calcio de las partes óseas del especímen sin dañar otros componentes, facilitando así el corte en secciones. El prerrequisito más importante para lograr una decalcificación satisfactoria es que el tejido deberá ser fijado antes de exponerlo al líquido decalcificante.
Se ha probado como satisfactorio el uso de 8% de ácido fórmico en agua destilada. Esta solución deberá revolverse a menudo (cada 8–12 horas) y cuando se complete la decalcificación, el tejido deberá ser transferido a alcohol 70°. Un método alternativo incorpora el uso de ácido tricloroacético en una solución al 5%, preparado en el momento. Con este método la decalcificación se produce bastante rápido obteniéndose una buena tinción posterior y, al igual que con el ácido fórmico, el tejido, luego de la descalcificación deberá ser transferido directamente a alcohol 70° antes de la deshidratación.
El mejor método para la descalcificación de tejidos de pescados es usar un agente quelante: ácido etilendiamino-tetra-acético (EDTA). Puesto que no se forman burbujas de gas con esta técnica, resulta menos probable la ruptura de los tejidos. La solución es activa en un pH neutro, de forma que no afecta las tinciones subsequentes.
Solución descalcificante EDTA
250 g EDTA
1750 ml agua destilada
Se ajusta la solución a un pH neutro por medio de la adición de NaOH. Con él se obtienen excelentes resultados, pero existen dos desventajas con este método:
Para conocerlo, la mejor forma es por medio de un examen de rayos x. El método menos exacto es la prueba química debido a la presencia o ausencia de iones de calcio.
Se agrega amoníaco fuerte a 5 ml del líquido descalcificante bajo examen hasta que la muestra quede aproximadamente neutra. A esto se le agrega 1 ml de oxalato de sodio o amoníaco al 5%. Si la solución queda turbia, indica que hay calcio presente. Si no se enturbia luego de un período de 5 minutos indica que el líquido no tiene calcio, lo cual significa que los sales de calcio fueron removidos del tejido y que se pueden realizar el resto de las etapas del procesamiento.
Los agentes descalcificantes son útiles en histología de peces. Sin embargo, existen limitaciones estrictas sobre su uso en el tegumento. A menudo se presume que la descalcificación de las escamas de peces resultará en mejores preparados de piel; lo cual rara vez es el caso, aunque las escamas contienen sales de calcio. La deformación y ruptura de la proteína en las escamas resultantes del empleo de agentes descalcificantes, a menudo impiden que la preparación resultante sea adecuada para realizar los exámenes subsiguientes.
Se realiza según Bullock 1978. Antes del procesamiento, es necesario estudiar la necesidad de realizar un tratamiento postfijativo, tal como la transferencia directa a una solución de alcohol; con líquido de Bouin o períodos extensos de lavado con líquido de Zenker.
Antes de poder examinar microscópicamente cualquier material fijado debe ser infiltrado con un medio que le de resistencia para permitir cortar las porciones delgadas (5–7 mm). Generalmente, la sustancia utilizada es la parafina, aunque pueden emplearse otras sustancias como celodine o gelatina. El proceso de fijación incluye deshidratación con alcohol de alta graduación, aclarándolo con agentes como xileno y el cloroformo, que permiten la posterior impregnación con cera.
Generalmente se inicia la deshidratación con una solución de alcohol 50–70° en agua a fin de prevenir la deformación que ocurriría si se transfiriera directamente al alcohol. Resulta una ventaja, particularmente cuando se trabaja con tejidos duros, como piel, incorporar al procesamiento una serie de baños en alcohol metil fenol al 8%, ya que el fenol produce un ablandamiento de los tejidos. Los tejidos, finalmente, se transfieren a un baño de alcohol absoluto para completar la deshidratación.
Puesto que el alcohol no puede mezclarse con la parafina, es necesario primeramente tratar el tejido con un agente que pueda mezclarse con ambas sustancias. Dentro de los varios agentes utilizados a estos fines, quizás el más comunmente usado sea el xylene, que además posee la ventaja de hacer que el bloque quede transparente luego de que la clarificación se complete. Es de acción rápida pero tiende a hacer que los tejidos queden frágiles luego de una exposición prolongada. Por otra parte, el cloroformo no produce el mismo efecto de endurecimiento que el xilene y se le considera más satisfactorio. Posee el inconveniente de que su punto de ebullición es muy bajo (60°C); si los bloques son transferidos directamente a la parafina a una temperatura mayor de 59°C, podría haber ruptura de tejidos con pésimos resultados. Según la experiencia del autor, los mejores resultados se obtuvieron clarificando los tejidos durante la noche con cloroformo y luego en dos etapas de media hora cada una con xilene.
Lo mejor es que la parafina tenga la misma dureza que el tejido a investigar, lo que rara vez se logra, debido a la gran variedad de consistencias de los tejidos de los peces. La dureza de la parafina se indica a través de su punto de fusión (M.P.), cuanto más dura es, mayor será su punto de fusión. Para trabajo rutinario con tejidos de peces con una considerable variedad de consistencias de tejidos, resulta particularmente útil un medio como el polywax que consiste en una mezcla de parafina y polímeros plásticos.
Esto brinda una matriz sólida que soporta al tejido y se realiza en envases de vidrio o porcelana, enfriando y endureciendo la parafina con trozos de tejido en el interior.
Los moldes de metal y vidrio deberán ser recubiertos con glicerina a fin de impedir que la parafina se adhiera a la superficie.
Luego se evapora la parafina fundida en el molde.
Por medio de una pinza calentada se transfiere y orienta el tejido.
Para su identificación se le etiqueta con un número.
Luego de su solidificación completa, el bloque se saca del molde y se monta sobre bloques de madera para su microtomía.
Por medio de un micrótomo se realizan cortes de bloques de 5μm. Se deberán considerar dos factores muy importantes para realizar cortes satisfactorios: a) un cuchillo limpio y afilado, y b) reducir la temperatura del bloque, si fuera necesario con hielo durante varias horas, lo cual aumenta su dureza. Esto resulta particularmente útil cuando se examina por ejemplo, piel.
Se hace flotar las secciones en un baño maría a 48°C y se colocan en portaobjetos limpios químicamente cubiertos con una fina capa de sustancia adhesiva como ser albúmina, glicerina.
Se deberá transferir las secciones en dos baños de xileno cada uno de 5–10 minutos de duración, luego por medio de graduaciones descendentes de alcohol, absoluto, 90°, 70°, 50°, a agua. Si fuera necesario se incluirá la eliminación de precipitaciones de mercurio.
Los distintos métodos para teñir se mencionan en el Apéndice VI.
Se transfiere las secciones a través de graduaciones ascendentes de alcohol, 50°, 70°, 90°, absoluto, y en dos baños de xileno.
Se retiran las secciones completamente deshidratadas, se las coloca en una gota de resina o bálsamo de Canadá y se las recubre con un cubreobjeto. El medio de inclusión deberá dejarse endurecer por algunos días.
