APENDICE I

INSTRUMENTOS NECESARIOS PARA DETERMINAR LOS PARAMETROS DEL AGUA DE MAR

1. Temperatura: para registrar las temperaturas se recomienda el uso de un termómetro protegido por madera.

2. pH: se determina empleando un termopehachímetro, que también puede servir como termómetro. Este aparato funciona a batería, es muy manuable para uso en el campo.

3. Oxígeno: se puede medir con un oxímetro del tipo WTW, a batería que es ideal para el trabajo de campo, pero dado su costo, puede ser reemplazado determinando el oxígeno disuelto mediante el método de Winkler, que tiene la ventaja de ser rápido y muy preciso para concentraciones muy bajas. En este caso hay que cuidar la metodología del muestreo, puesto que para muestras de fondo, estas deben llegar sin burbujas y sin estar en contacto con la superficie.

4. Salinidad: el método más práctico para su determinación es un refractómetro portátil, ya que permite la lectura directa de la salinidad.

5. Turbidez: se mide con el disco de Secchi, que es un disco de 20 cm de diámetro, con cuadrantes negros y blancos. Se puede construir con una chapa pintada y una soga (Figura 17).

Figura 17 Disco de Secchi.

APENDICE II

FERTILIZACION

Los fertilizantes que se utilizan son muy variados y los podemos clasificar en dos categorías, orgánicos e inorgánicos.

a)   Fertilizantes orgánicos : Por lo general son desechos animales tales como excrementos de cerdos, ganado vacuno, aves, etc, su obtención es fácil y son de bajo costo, pero presentan la desventaja de producir contaminación bacteriana y el peligro latente de una baja en la cantidad de oxígeno disuelto que en algunos casos llega a niveles letales.

En cuanto a la cantidad a utilizar Primavera y Apud (1980) en estanques de cría de P.monodon recomiendan el agregado de 1000 a 3000 Kg/Ha de excremento de pollo seco.

En la cría de P. stylirostris y P.vannamei, en Panamá se recomienda el uso de estiercol de ave en cantidades que varíanentre 300 y 350 Kg/Ha siendo los valores mas bajos para aguas de salinidades medias y los últimos para mayores. (Dirección Nacional de Acuicultura de Panamá, 1984); en otros trabajos con las mismas especies se utilizan estiercol de ganado y aves colocándolos en concentraciones de 910 Kg/Ha hasta 2000 Kg/Ha (Pretto et al., 1983).

Para realizar la fertilización el suelo debe estar seco y arado, luego se esparce el fertilizante elevándose primero el nivel de agua a 10/20 cm, manteniéndolo por 4 a 7 días para luego dlevarlo a un nivel deseado.

b)   Fertilización inorgánica: Aunque mas cara es más eficiente y no presenta los problemas del caso anterior. Los abonos utilizados son nitrogenados, fosfatos y potásicos que pueden utilizarse sólo o combinados. El principal abono nitrogenado es la urea, mientras que las fuentes de fósforo son: superfosfato, fosfato de amonio, fosfatodicálcico.

En general estos abonos se utilizan combinados: por ejemplo Primavera y Apud (1980) en Filipinas recomiendan 100 Kg/Ha de abono 18(N): 40 (P): 0(K) o 200 Kg/Ha de una mezcla 16 (N); 20 (P): 0 (K). En Panamá los fertilizantes mas usados y que vienen preparados son: 12 (N): 24(P): 12 (K) o 20 (N): 20 (P): 0 (K). (Dirección Nacional de Acuicultura, Panamá, 1984).

En Estados Unidos, Texas Chamberlain et al., 1981b utilizan para engorde de P.stylirostris y P.vannamei 45 Kg/Ha de urea (46:0:0) y superfosfato (0:20:0) 15 Kg/Ha. En cuanto al langostino argentino Pleoticus muelleri se han obtenido buenos resultados con 43 Kg/Ha de urea y 6Kg/Ha de fosfato diamónico (Fenucci et al., 1987.

APENDICE III

IDENTIFICACION DE ESTADIOS Y SUBESTADIOS LARVALES DE CRUSTACEOS PENEIDOS

La identificación diaria de los estadios de larvas que se encuentran en los tanques de cría es de suma importancia no solo para determinar la marcha de la operación sino para saber el tipo de alimento que se debe agregar y la concentración del mismo.

Estado Naupliar: Del huevo que por lo general mide unos 280μ eclosiona una larva nauplii, el tamaño de este estadio que se puede subdividir en 4 o 5 subestadios tiene un tamaño que varía entre 0.2 y 0.6 mm, tiene forma periforme, furca caudal, antena y anténula y mandíbula, a medida que se van alcanzando los distintos subestadios se va produciendo un alargamiento del cuerpo, variaciones en la anténula y antena y en la furca caudal con el agregado de espinas. En el estadio naupliar III la segmentación del tórax se hace evidente y a partir del IV aparecen los apéndices cefalotoráxicos, mientras las mandíbulas rudimentarias aparecen en el estadio V. (Figura 18 A y B)

Estadio de Protozoea: Tamaño 0.6 – 2.8 mm. El cuerpo se encuentra dividido en cabeza y resto del cuerpo formado por el tórax y abdomen, la cabeza está cubierta por un caparazón hexagonal, caracter este distintivo de la protozoea, se lo puede dividir en tres subestadios:

Estadio de Mysis: Tamaño 2.8 – 5.2mm, cuerpo alargado parecido al de un camarón, pereiópodos bien desarrollados y funcionales, sin pleópodos, en el primer estadio. (Figura 19 A, B y C)

Generalizando se puede decir que las dosis de fertilizantes a utilizar por héctarea estarían entre: 50/60 Kg. de N; 30/60 Kg P y 30/40 Kg K.

Estos fertilizantes se pueden agregar cuando hay agua en los estanques, colocando bolsas de los mismos en plataformas de madera, el nivel de agua se mantendrá en 20–30 cm entre 4 y 7 días para'luego llevar la columna de agua a la altura deseada.

En todos los casos, salvo cuando existan problemas en la calidad del agua, es conveniente repetir la fertilización con la mitad de las cantidades inciales cada 15 días luego de colocados los animales en el estanque.

Estadios postlarvales: Muy parecido en su aspecto al camarón juvenil o adulto, talla entre 5 y 25 mm, presenta un rostro romo, pleópodos con sedas, reducción notoria de los exopoditos de los pereiópodos, cosa que ocurre gradualmente en unas pocas especies. Para Artemesia longinaris Boschi y Scelzo (1977) establecen que se alcanza el estadio juvenil cuando el primer pleópodo del macho desarrolla su endopodito. (Figura 19 D)

Figura 18. Estadios larvales de un peneido típico. A: nauplius I; B: nauplius V; C: protozoea I; D: protozoea II; E: protozoea III.

Figura 19. Estadios larvales de un peneido típico. A: mysis I; B: mysis II; C: mysis III; D: postlarva.

APENDICE IV

CULTIVO DE ALGAS UNICELULARES

Las microalgas constituyen el principal alimento de los camarones en el estadio de protozoea. Por lo general, una sola especie de microalgas no satisface todos los requerimientos nutricionales de la especie en cultivo, por lo que es común el empleo de mezclas de algas.

Las algas que se utilizan más frecuentemente son: Tetraselmis chuii, T. suecica (Prasinophyceae), flagelado marino de alto valor alimentario y las diatomeas (Bacillariophyceae) Chaetoceros calcitrans, C.rigidus, C.sp., Skeletonema costatum y Thalassiosira sp.

IV. 1. TIPOS DE CULTIVOS. OBTENCION DE CEPAS PURAS

Los cultivos pueden ser monoalgales o plurialgales, axénicos (libres de bacterias) o no, de pequeña, mediana o gran escala.

Para disponer de grandes volúmenes que aseguren una provisión permanente de alimento, es necesario partir de cepas puras que pueden obtenerse de dos maneras:

IV.1.1. Adquiriendo stocks puros en centros especializados (Stein, 1973), algunos de los cuales son:

• “Culture Collection of Algae”. Department of Botany. Indiana University. Bloomington, Indiana 47401, U.S.A.

• “American Type Culture Collection”. 12301 Parklawn Drive. Rockville, Maryland 20852, U.S.A.

• “Culture Collection of Algae”. Woods Hole Oceanographic Institution. Woods Hole, Massachusetts 02543, U.S.A.

• “Carolina Biological Supply Company”. Burlington, North Carolina 27215, U.S.A.

• “Culture Centre of Algae and Protozoa”. 36 Storeys Way. Cambridge, CB3 ODT, England.

• “Marine Biological Association of the United Kingdom”. Citadel Hill. Plymouth, PLI 2 PB, England.

• “Sammlung von Algenkulturen”. Planzenphysiologisches Institut der Universität Göttingen. 18 Nikolausbergerweg, Göttingen, West Germany.

• “Algal Culture Collection”. Institut of Applied Microbiology, University of Tokyo, Japan.

IV.1.2. Aislando las algas a partir de muestras provenientes de la zona donde se encuentra la eclosería.

En laboratorio (pequeña escala) se pueden aislar y mantener cultivos monoalgales según la siguiente rutina de trabajo; a) separar bajo lupa o microscopio las células o cadenas de células de la especie que se desea cultivar, utilizando una micropipeta; b) lavar reiteradamente (no más de seis veces) con agua de mar; c) sembrar en tubos de ensayo en 10 ml con agua de mar filtrada y enriquecida. Esta operación se repite cada cuatro o cinco días, dependiendo de la velocidad de crecimiento del alga y su ciclo celular, empleando en todos los casos elementos esterilizados y agua de mar envejecida y filtrada a través de una membrana de celulosa de 0,22 – 0,50 μ de tamaño de poro e irradiada con luz ultravioleta, hasta obtener una cepa pura. A fin de obtener una información completa sobre las técnicas de aislamiento a emplear, se recomienda consultar el “Handbook of Phycological Methods” (Stein, 1973).

IV. 2. MEDIOS DE CULTIVO

El agua de mar es el medio ideal para el cultivo de algas marinas, pero es necesario enriquecerla mediante el agregado de macronutrientes y micronutrientes inorgánicos (trazas de metales), vitaminas y quelantes, a fin de asegurar condiciones óptimas de crecimiento y alta densidad celular.

Hay diversos medios ampliamente utilizados para cultivar distintas especies de algas, unos son simples y otros más sofisticados. Entre los primeros se encuentra el empleado por Boschi y Scelzo (1977) para Skeletonema costatum, en el que por cada 100 l de agua de cultivo se agregan: 1, 0 g NO₃K, 0,5 g PO₄HNa₂, 0,5 g Si0₃Na, 0,98 g EDTA, 0,054 g CIFe y 100 μg Vitaminas B₁₂. De los medios sofisticados o complejos el “F” de Guillard (se. emplea modificado como f/2) es probablemente el más difundido, ya que favorece el crecimiento de la mayoría de las algas, entre los macronutrientes incluye nitratos, fosfatos y silicatos pero estos últimos se usan específicamente para cultivo de diatomeas, para otras algas (Chlorophyceae, etc) no se agregan al medio; en todos los casos se incluye el quelante EDTA que mantiene en solución metales esenciales para la actividad celular. En la Tabla 5 se dan las fórmulas de éste y otros medios muy utilizados.

Además de los medios naturales (agua de mar enriquecida mediante la adición de sustancias), pueden emplearse medios sintéticos que involucran mayores costos, en cuya formulación se usa agua destilada, nutrientes y sales marinas artificiales. El medio sintético “NH” de Gates y Wilson, cuya composición. se describe en la Tabla 6 se utiliza para distintas microalgas en el Laboratorio de Galveston del National Marine Fisheries Service. Otro medio muy usado es Instant Ocean TM, que es una combinación de sales de mar sintéticas y el medio “F” de Guillard.

A fin de alcanzar la producción algal requerida en condiciones de cultivo, es necesario conocer la dinámica de crecimiento de las algas, así como utilizar un medio adecuado y condiciones físicas favorables. Este crecimiento está caracterizado por distintasfases: 1) adaptación al medio de cultivo, 2) exponencial, 3) estacionaria, 4) muerte. La primera fase se refiere a la introducción del inóculo en el medio de cultivo; hay crecimiento celular, pero no divisiones. La fase exponencial se caracteriza por rápidas y continuas division celulares, la intensidad lumínica y la temperatura son factores limitantes en esta etapa. Hacia el final de esta fase sobreviene la declinación relativa del crecimiento pues actúan múltiples factores limitantes como disminución de algún nutriente, del tenor de O₂ ó CO₂, presencia de catabolitos, variación de pH, etc. En la fase estacionaria se alcanza el equilibrio entre el coeficiente de crecimiento y los parámetros físicos, no hay más divisiones celulares. Finalmente sobreviene la fase de muerte del cultivo que se caracteriza por la sedimentación de las células, aparición de células vacías y si se trata de algas que forman cadena como S. costatum, éstas son cortas y las células circulares.

Tabla 6. Medio “NH” (Cates y Wilson, 1960)

1. Súlfidos:
   NH₄Cl - 0.2 g, KH₂PO₄ - 0.1 g, MgCl.6H₂O - 0.04 g, NaHCO₃ - 0.2 g, Na₂S.9H₂O - 0.15 g. Completar hasta 1000 ml con aguadestilada.

2. Vitaminas (Mezcla “8”):
   Tiamina HCl - 20 mg, biotina - 50 μg, B₁₂ - 5.0 μg, ácido fólico - 0.25 mg, ácido p-amino benzoico - 1 mg, ácido nicotínico - 10 mg, timina - 80 mg, colina-50 mg, inositol - 100 mg,putrescina - 0.8 mg, riboflavina - 0.5 mg, piridoxina - 4.0 mg,piridoxamina - 2.0 mg, ácido orótico - 26 mg. Completar hasta1000 ml con agua destilada.

3. Metales “T”:
   Soluciones al 1%: 2.5 ml Fe tartrato (5 mg Fe), 3.0 ml H₃BO₃(5.1 mgB), 0.1 ml H₂SeO₃ (1 mg Se), 0.12 NH₄VO₃ (0.5 mg V), 0.11ml K₂CrO₄ (0.2 mg Cr), 0.37 ml MnCl₂ (1.0 mg Mn), 0.83 ml TiO₂(5 mg Ti), 5.0 ml NaSiO₃ (5.0 mg Si), 0.4 ml ZrOCl₂ (2 mg Zr),0.15 ml BaCl₂ (1 mg Ba). Completar hasta 1000 ml con agua destilada

El éxito y eficiencia del cultivo está dado por el mantenimiento de éste en la fase de crecimiento exponencial.

IV.3   PRODUCCION MASIVA DE ALGAS

Si bien la máxima densidad de microalgas en cultivo depende de la especie y tamaño celular, generalmente se trabaja en un rango de 10⁶ – 10⁷ células/ml, partiendo de inóculos de densidad celular relativamente alta (0,2 - 2 × 10⁶ cél/ml).

Una vez obtenida la cepa pura, en tubos de ensayo (con una concentración de 1 – 10 × 10⁶ cél/ml) los stocks se mantienen en condiciones de iluminación continua (12 horas de fotoperíodo son suficientes para diatomeas) a 20°C, por un período aproximado de 30 días empleándose la mitad para inocular la fase siguiente y la otra mitad de reserva. En la segunda etapa se utilizan erlenmeyer de 250 ml y no es necesaria la aireación del sistema, pero sí la iluminación (tubos fluorescentes de 40 W). A los cuatro días, con el contenido de los erlenmeyer, se inoculan botellones estériles de 6 l, aunque pueden usarse frascos de 21 1 (Mock, 1974; San Feliú et al., 1976), damajuanas de 9 l (Griffith et al., 1973), 12–20 l (Fox, 1983), balones esféricos de 20 1 (Flassch, 1978). Al respecto existen diferentes técnicas que si bien básicamente son iguales, presentan modificaciones según el lugar y las necesidades de cada caso. Los cultivos en esta etapa requieren además aireación y al cuarto día se usan para inocular volúmenes mayores.

La etapa siguiente es de producción a mediana escala, para lo cual se utilizan bolsas colgantes de polietileno transparente, de 25 1 de capacidad, colocadas en una estructura de madera provista de una serie de tubos fluorescentes y suministro de aire. A los cuatro días se obtienen elevadas concentraciones de algas, empleándolas como inóculo de la siguiente etapa. En vez de bolsas de polietileno pueden usarse tanques cónicos, cilíndricos o rectangulares de fibra de vidrio transparente de 25 1 hasta 200 1 con iluminación continua. En la última fase, de cultivo a gran escala, se utilizan bolsas de polietileno de 500 – 600 lt., sostenidas por una red sujeta a una estructura metálica ó tanques de fibra de vidrio de 300 ó más litros de capacidad, en tres a cinco días se dispone de altas concentraciones celulares.

Por lo general se considera que en volúmenes mayores de 200 1 es muy difícil evitar las infecciones (protozoos, hongos, bacterias), pues no es un sistema cerrado y está sujeto a contaminación, pero aún así es necesario trabajar en todos los casos en las mejores condiciones de asepsia posibles (recipientes esterilizados, agua de mar filtrada, medios enriquecedores autoclavados, tanques tratados con 150 ppm de solución de hipoclorito de sodio, etc.) ya que, en caso de presentarse infecciones en los cultivos, hay que desecharlos y comenzar nuevamente las operaciones.

Para desarrollar las actividades relacionadas con los cultivos de algas debe contarse con un laboratorio para tareas generales, una sala para trabajar en condiciones estériles y otra para efectuar los cultivos tanto de mantenimiento como de producción, así como con equipo adecuado para control de la temperatura y aireación. Seeliger y Vieira Cordazzo (1980), proponen criterios a tener en cuenta en la construcción de una unidad de producción de algas.

La etapa de conservación y almacenamiento de las algas también es importante, ya que mediante esta operación se asegura la provisión de alimento de alta calidad para las larvas durante períodos prolongados, por ej. a temperaturas de -20°C, -22°C, congeladas con protectores y almacenadas, Chaetoceros calcitrans se mantiene durante 18 meses, S. costatum 2 meses y Tetraselmis chuii 4 meses (Liao et al., 1983). De este modo se reduce la dependencia de la eclosería de la producción de cultivos de algas.

Los cultivos pueden almacenarse concentrados y congelados, como polvos deshidratados congelados, refrigerados o bien secados al sol. La concentración por centrifugación se obtiene utilizando una desnatadora (Mock, 1974), con flujo continuo y a velocidad controlada (bajas revoluciones). Hay que tener en cuenta que el flujo está determinado por la especie de alga cosechada y la velocidad de rotación del separador. Las células quedan depositadas sobre las paredes del separador por acción de la fuerza centrífuga, formándose una pasta de algas. Esta se suspende en un volumen conocido de agua, se agita y se determina la densidad celular de la solución por dilución y recuento con hemocitómetro. Distintos autores utilizan en esta etapa, agentes crioprotectores como glucosa, glicerol 10% (Flassch et al., 1975) y dimetilsulfóxido, para mantener la integridad celular durante el proceso de congelación. La solución con conservadores adicionados se separa en tubos plásticos según la concentración requerida para tanques de un determinado volumen (10.000 – 20.000 cél/ml). En relación al uso de crioprotectores, deben realizarse más estudios, ya querse ha comprobado que algas cultivadas sometidas a este tratamiento han sido perjudiciales para las larvas (Mock, comunicación personal) y por otra parte, especies como T. chuii parecían mantener su estructura celular intacta después de congelada y posterior resuspensión, en ausencia de estas sustancias.

La utilización de agentes químicos para concentrar cultivos de algas, se basa en el uso de floculantes como sulfato de aluminio, que provocan la precipitación de las células y también otros floculantes combinados con una carga elétrica; de este modo la cosecha puede realizarse por sifonado del sobrenadante.

La preparación del polvo deshidratado y congelado, involucra el uso de un equipo costoso. Antes de su utilización debe ser particularizado a un tamaño conveniente y resuspendido en agua, pero es necesario agitar la solución para evitar la formación de grumos.

El volumen del concentrado requerido para alimentar los organismos en cultivo se calcula en base a la siguiente ecuación:

donde:    V: volumen necesario para alimentación
V; volumen total de concentrado
C: número total de células necesarias para alimentación
c: número total de células del concentrado

Este volumen así calculado, puede agregarse al tanque de larvas mediante el empleo de una bomba automática (Mock y Neal, 1977).

En cuanto al momento propicio para realizar la cosecha es necesario tener en cuenta las características de las distintas especies. Por ej. Skeletonema costatum debe cosecharse 2 ó 3 días después de la inoculación, al final de la fase exoponencial, ya que en la fase estacionaria esta especie no presenta buenas cualidades alimentarias. (Liao et al., 1983).