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6. METODOS DE DIAGNOSTICO

6.1 Exámenes bacteriológicos

Con el fin de lograr un diagnóstico confirmativo de las enfermedades bacterianas de los salmónidos, es imprescindible que el agente etiológico correspondiente sea aislado e identificado en el laboratorio, siendo la única excepción a esta regla la enfermedad bacteriana del riñón en donde el diagnóstico se fundamenta en un examen de un extendido del riñón y/o de otros órganos para poner de manifiesto la presencia de numerosos diplobácilos Gram positivos.

Se permite solamente el uso de peces vivos o moribundos, dado que al morirse los peces éstos son rápidamente invadidos por organismos saprofíticos presentes en el agua y sobre la superficie de la piel, y de esa manera se complica o se dificulta el diagnóstico. El primer paso es el de hacer un examen macroscópico del pez para detectar cualquier lesión, abceso, o forúnculo. A partir de esas anormalidades se preparan extendidos los cuales se examinan microscópicamente para detectar la presencia de mixobacterias, bacterias móviles o inmóviles, etc. El área de la superficie de la lesión se cauteriza cuidadosamente mediante el uso de un cuchillo o bisturí caliente, y el material se toma a partir del tejido con una asa de platino flameada para su posterior siembra en el medio de cultivo. En casos en los cuales no se detecta la presencia de lesiones externas, la superficie del pez se desinfecta cuidadosamente con un trozo de algodón empapado en un producto aprobado en base a yodo orgánico, y una vez seca la superficie (aproximadamente un minuto) se procede a abrir la cavidad abdominal del pez con instrumentos esterilizados para exponer órganos internos in situ. El material para los cultivos se toma con una asa de platino flameada de los órganos internos, y especialmente del riñón, bazo, e hígado.

Los siguientes procedimientos representan las técnicas mínimas aceptables para fines del diagnóstico bacteriológico de enfermedades de salmónidos y deben ser utilizados para toda muestra tomada a partir de lotes y/o poblaciones en los cuales se experimenta una apreciable incidencia de señales clínicas anormales y/o mortalidades. En aquellas muestras procedentes de lotes de peces aparentemente sanos, los mismos procedimientos pueden ser aplicados solamente a peces cuya longitud estándar es de cuatro centímetros (4 cm) o más.

  1. Estriar material tomado asépticamente a partir del riñón (al ser posible de áreas con un aspecto normal) en los siguientes medios de cultivo:

    1. agar forunculosis (FA);
    2. agar Cytophaga (CA);
    3. agar tripticasa soya (TSA);
    4. agar cólera (CM);
    5. agar Mueller-Hinton enriquecido con cocarboxilasa;

    La composición y modus operandi de la preparación de los diferentes medios de cultivo se detallan en el APENDICE A.

  2. Preparar extendidos del mismo material, colorear según el método de Gram, y examinar microscópicamente para detectar la presencia de bacterias. La presencia de pequeños diplobácilos Gram positivos, a menudo en forma intracelular, constituye evidencia presuntiva para el diagnóstico preliminar de Renibacterium salmoninarum, agente etiológico de la enfermedad bacteriana del riñón.

  3. Las placas inoculadas se incuban a los 20–25°C durante diez (10) días, y se examinan diariamente para detectar la presencia de colonias de microorganismos. Una placa duplicada de agar Cytophaga se incuba a los 10°C para detectar la presencia de Cytophaga psychrophila.

  4. Seleccionar colonias juveniles representativas de las placas de agar Cytophaga y hacer extendidos de las mismas. Colorear según el método de Gram y examinar microscópicamente. La presencia de bastones largos y delgados, Gram negativos, los cuales están dotados de un movimiento de deslizamiento, constituye evidencia para el diagnóstico presuntivo de casos de mixobacteriosis.

  5. Seleccionar colonias juveniles representativas de las placas de agar forunculosis, agar tripticasa soya y agar cólera. Proceder a la identificación preliminar de las bacterias en base a los siguientes caracteres:

    1. Si las células son Gram negativas, en forma de bastón, citocromoxidasa positivas y móviles, el organismo posiblemente sea una especie de los géneros Aeromonas, Pseudomonas o Vibrio.

    2. Si el organismo se diferencia de los mencionados en el renglón anterior por ser citocromoxidasa negativo, posiblemente se trata de Yersinia ruckeri, agente etiológico de la enfermedad de la boca roja.

    3. Si el organismo se diferencia de los mencionados en los renglones (a) y (b) arriba por ser inmóvil y en la producción de un pigmento marrón oscuro hidrosoluble en placas de agar forunculosis y de agar tripticasa soya, posiblemente sea Aeromonas salmonicida, agente etiológico de la forunculosis.

    4. Si el organismo se desarrolla solamente en agar Mueller-Hinton enriquecido con cocarboxilasa, y no en los demás medios de cultivo, y tiene forma de bastón Gram negativo e inmóvil, es casi seguro que se trata de Haemophilus piscium, agente etiológico de la enfermedad de la úlcera.

    Cualquier diagnóstico presuntivo de la presencia de los agentes etiológicos de enfermedades bacterianas de los salmónidos de interés para la certificación ictiosanitaria debe ser confirmado en el laboratorio mediante la realización de las pruebas bacteriológicas, serológicas y/o inmunológicas correspondientes. Las características más importantes de estas bacterias ictiopatógenas se detallan en la TABLA 3. La identifación taxonómica precisa de estas bacterias ha de efectuarse en base a sus caracteres morfológicos, bioquímicos y, cuando eso corresponde, inmuno-serológicos.

Las principales técnicas utilizadas en la identificación de las bacterias asociadas con las más importantes enfermedades infecto-contagiosas de los peces son las que se detallan a continuación:

  1. Prueba de movilidad: se remueve una colonia juvenil de la superficie de una placa del medio de cultivo debidamente sembrado, y se efectúa su emulsión en una gota de agua sobre un portaobjeto; la suspensión bacteriana se cubre cuidadosamente con un cubreobjeto, asegurando que no queden atrapadas burbujas de aire; la suspensión se examina microscópicamente con un aumento de × 40 y de × 100; los organismos móviles muestran un movimiento activo en el campo microscópico, el cual no debe confundirse con el movimiento browniano; la presencia de bastones delgados y largos que muestran un deslizamiento evidencia la presencia de mixobacterias en el material en estudio.

  2. Coloración de Gram: se prepara un extendido del material a ser examinado sobre un portaobjeto, fijándolo por el calor; se agrega una solución acuosa al 1% de violeta de genciana durante treinta (30) segundos; se lava con agua y se agrega yodo de Lugol durante treinta (30) segundos como mordiente; se elimina el yodo de Lugol y se lava el extendido con agua; se agrega alcohol etílico al 95% hasta que el extendido esté decolorado, y se lava bien con agua; se contracolorea con fucsina de Ziehl diluida con agua 1:10 durante treinta (30) segundos; se lava con agua, se seca con papel secante o de filtro, y se examina microscópicamente usando un objetivo de inmersión en aceite. Las bacterias Gram positivas se colorean de un azul purpurado profundo, mientras que las bacterias Gram negativas se colorean de un rojo rosado. La fuscina de Ziehl tiene la siguiente composición:

    fucsina básica300 mg
    alcohol etílico10,0 ml
    fenol5,0 g
    agua destilada95,0 ml
  3. Prueba de citocromoxidasa: se remueve una colonia juvenil de la superficie de una placa de agar sembrada, y se transfiere la masa de bacterias al área de prueba de una tirita de papel impregnado con una solución acuosa al 1% de clorhidrato de tetra-metil-p-fenilenodiamina, rociándola cuidadosamente. La formación de un color azul profundo dentro de un período de sesenta (60) segundos se interpreta como una reacción positiva de citocromoxidasa.

  4. Prueba de oxidación y fermentación de la glucosa: se calientan dos (2) tubos de medio O/F con glucosa al 1% para eliminar aire disuelto, y se dejan enfriar a la temperatura ambiente. Cada tubo se inocula con un cultivo de la bacteria en investigación. Uno de los tubos inoculados se cubre con una mezcla de aceite mineral y parafina estéril para evitar la entrada de aire, hasta una profundidad no menor de 1 cm. Los dos tubos se incuban a los 20–25°C durante cuarenta y ocho (48) horas. La formación de una coloración amarillenta en uno o en ambos tubos indica la producción de ácido. La presencia de ácido en los dos tubos significa que la glucosa ha sido metabolizada por vía fermentativa, mientras que la presencia de ácido en el tubo cuya superficie ha estado en contacto con el aire, y no en el tubo cuya superficie ha sido cubierta con la mezcla de aceite mineral y parafina estéril, indica que la glucosa ha sido metabolizada por vía oxidativa. Si no ha habido cambio en el color azul de ninguno de los dos tubos, eso indica que no ha tenido lugar reacción alguna. Es importante detectar la presencia de ácido con gas o de ácido sin gas en los tubos, dado que eso indica si la fermentación es aerogénica o anaerogénica respectivamente. Para ello se procede a la inoculación de agua peptonada con glucosa en un recipiente que contenga una campanita de Durham. En casos donde se sospecha que el agente etiológico aislado es un vibrio, debe emplearse el agar cólera para su diagnóstico presuntivo.

  5. Prueba de 2,3 - butanediol: esta prueba es de utilidad en el diagnóstico presuntivo de cepas de Aeromonas liquefaciens, puesto que casi ninguna otra bacteria ictiopatógena da una reacción positiva. Se inoculan tubos de 5 ml de caldo nutritivo conteniendo 10% de glucosa con el organismo en estudio y se incuban a los 20°C durante cuarenta y ocho (48) horas. Se procede a comprobar la presencia de 2,3 - butanediol según la metodología que se detalla a continuación:

    1. agregar 1 ml de ácido periódico al 2,3%; agitar suavemente el tubo y dejar durante quince (15) minutos a la temperatura ambiental;

    2. agregar 1,5 ml de una solución de piperazina que contenga 25 g de hexahidrato de piperazina disuelto en 99 ml de agua destilada; agregar 1,3 ml de ácido fórmico al 87% y seguidamente agregar 0,5 ml de una solución acuosa RECIEN PREPARADA de nitroprusiado de sodio al 4%;

    3. la producción de una marcada coloración azulada dentro de los dos (2) minutos indica la presencia de 2,3 - butanediol; una coloración verde pálida se interpreta como un resultado negativo;

  6. Prueba de parafenilenodiamina: esta prueba puede ser usada como complemento en el diagnóstico presuntivo de casos de la forunculosis causados por Aeromonas salmonicida. Un tubo, o una placa, de agar tripticasa soya (TSA) o agar forunculosis (FA) se siembra con el organismo inmóvil en estudio, y se incuba a los 20°C durante veinticuatro (24) horas. Se agrega 0,5 ml de una solución acuosa de parafenilenodiamina al 1% (la cual puede ser mantenida durante 30 días en la nevera), y se mueve suavemente el tubo o la placa durante tres (3) segundos de tal manera que el reactivo entre en contacto directo con las colonias bacterianas. La producción de una coloración morada o púrpura oscura dentro de 45 segundos a 3 minutos constituye una reacción positiva.

  7. Prueba de sensibilidad al agente vibriostático: se prepara una solución acuosa al 0,1% de 2:4 diamino 6:7 di-isopropil piridina fosfato, la cual se esteriliza por filtración usando un filtro Seitz. Se agregan discos de papel de filtro estériles, de un diámetro de 6 mm, a un recipiente estéril al cual se agrega la solución del reactivo a razón de 0,01 ml/disco. Los discos empapados se secan a los 37°C. Se siembra una placa del medio de cultivo correspondiente con el organismo en investigación, colocando seguidamente un disco impregnado con el vibriostato en el centro de la placa. Se incuba la placa 20–25°C durante 24–48 horas. La presencia de una zona clara y sin desarrollo bacteriano alrededor del disco indica sensibilidad al vibriostato y constituye evidencia presuntiva de un vibrio.

  8. Reacción de ácido resistencia: esta técnica de coloración es de singular utilidad en la práctica, dado que facilita el reconocimiento de bacterias ácido-resistentes (por ejemplo: Mycobacterium y Nocardia spp.) en frotis y preparados tomados a partir de lesiones y granulomas. Se prepara un extendido o frotis del material a ser examinado sobre un portaobjeto, fijándolo por el calor. Se cubre la superficie del extendido con fucsina de Ziehl (ver renglón (ii) arriba, calentando la parte inferior del portaobjeto con un trozo de algodón empapado en alcohol hasta que se desprende vapor: NO HERVIR EL COLORANTE NI DEJAR SECARSE EL EXTENDIDO. Se deja actuar al colorante durante veinte (20) minutos, y se decolora con alcohol-ácido (etanol al 70% con 1% de ácido clorhídrico) hasta que todos los rastros del colorante hayan desaparecido del extendido. Se lava con agua, y se contracolorea con una solución acuosa al 1% de azul de metileno durante 30–60 segundos. Se lava con agua, se seca con papel de filtro o papel secante y se examina microscópicamente usando un objetivo de inmersión en aceite × 100. Las bacterias ácido-resistentes se colorean de un color rojo, mientras que las bacterias no ácido-resistentes, células tisulares, etc., se colorean de un azul pálido.

6.2 Exámenes micológicos

El aislamiento in vitro de los hongos asociados con diversas enfermedades de los salmónidos (por ejemplo: Achyla, Saprolegnia, Ichthyophorus) (nueva ubicación taxonómica del hongo) generalmente puede llevarse a cabo mediante la siembra sobre placas de un medio de cultivo correspondiente tal como agar glucosado de Sabouraud con neomicina y ciclohexamida (ver APENDICE A), con material tomado a partir de las zonas afectadas del pez. Una vez sembrado el medio de cultivo, la placa se incuba a los 25°C y se observa regularmente para detectar la formación del micelio y de los órganos sexuales del hongo, la morfología de los cuales facilita la identificación taxonómica del mismo.

6.3 Exámenes parasitológicos

6.3.1 Técnicas para el Diagnóstico de Myxobolus cerebralis (Enfermedad del Torneo)

6.3.1.1 Procedimiento de diagnóstico pará situaciones de enfermedad

Sacar 5 cabezas de peces sospechosos y calentarlas en agua a 45°C por 1 a 3 minutos para que la carne se separe fácilmente del hueso y cartílago. Remover la carne suelta y el cerebro a un recipiente de basura que contenga agua y lejía doméstica en una proporción de 1:1, recolectar las muestras de huesos y región de la cápsula creaneana, región de los otolitos y arcos branquiales, triturar con un volumen igual de formol al 10% para matar a las esporas viables (y evitar la diseminación del agente etiológico de la enfermedad) en un mortero.

Lavar todo lo que se tritura en un vaso de precipitación con agua permitiendo sedimentar el material. El sedimento puede examinarse directamente en preparados frescos a un aumento de 400 o usando el método de MacClean, distribuir 5 a 10 gotas del sedimento en un portaobjeto limpio y dejar que se seque en el aire, el portaobjeto se colorea con verde de malaquita acuoso al 1% durante 5 minutos, se lava con agua de grifo y se decolora al colocarse en alcohol etílico del 70, 90 y 100% las láminas por 30 minutos, se cubren totalmente estas láminas con una delgada película de aciete de inmersión de baja viscosidad y se examina con el lente de × 20 y ocular de × 10 (no bajo inmersión).

Revisar todo el extendido. Las esporas aparecen como óvulos verdes con cápsulas polares verdes intensos contra un fondo casi incoloro.

6.3.1.2 Procedimiento para la detección de infecciones asintomáticas

Utilice un cuadro de muestreo que posea la capacidad de detectar la enfermedad a un nivel de incidencia del 5%. Las muestras deben separarse conforme a las especies y edades más susceptibles de los peces que están disponibles. Por ejemplo seleccione “truchas de arroyo” y “trucha arco-iris”, más que trucha marrón y salmón coho, si todas se cultivan en las mismas condiciones y seleccione dedinos de unos 5 meses de edad, si los peces se exponen continuamente en aguas de 13°C o más. Peces tan jóvenes como de 2–3 meses de edad pueden proporcionar esporas maduras; en aguas por debajo de 12°C, puede que los peces tengan que alcanzar 8–10 meses de edad antes de poderse hallar esporas maduras. Los siguientes procedimientos son aceptables para la detección de portadores:

6.3.1.2.1 Método de digestión
  1. Sacar las cabezas de los peces que se han muestreado y refrigerar si es necesario a 5°C.

  2. Calentar las cabezas en agua a 50°C durante 5–10 minutos, sacar y desechar la mandíbula inferior, ojos, piel y tejidos en general, pero guardar los arcos branquiales, cartílago craneal, o hueso, o ambos; pesar al gramo más próximo.

  3. La maceración de los elementos craneales de peces juveniles es opcional; las cabezas óseas de peces de mayor edad, deberían macerarse en una maquinilla, mezclar bien y examinar una pequeña muestra para detectar la presencia de esporas; si no se encuentran proceder con el paso (d) (si se desea que la eficiencia de la recuperación de esporas esté cuantificada, antes de la maceración puede agregarse nitrato de plata para que las esporas sean coloreadas).

  4. Agregue 20 a 25 volúmenes de solución pepsínica* y digerir a los 37°C por 30 minutos (siendo normalmente suficiente para material de peces juveniles). Puede requerirse hasta 4 horas para la reducción de huesos de peces adultos; centrifugar el digerido a 1200 g durante 10 minutos a 20–25°C; descartar el sobrenadante.

  5. Agregue 15–20 volúmenes de solución tripsínica ** al residuo pepsínico del paso (d) (arriba) y ajustar el pH a 8–8,5; digerir a 20–25°C con agitación durante 30 minutos.

  6. Pare la digestión al agregar 0,1 de volumen de suero o 0,1 de suero - albúmina de bovino al 10%, eliminar los residuos no digeridos por filtración a través de un empaque de lana de vidrio o de material de malla fina.

  7. Centrifugar la suspensión a 1200 g a 20–25°C, descartar el sobrenadante, resuspender el pellet en 8–10 volúmenes de agua o solución salina balanceada, examinar para detectar esporas y si no se encuentran proceder con el paso (h).

  8. A tubos de centrífuga o botellas de un tamaño correspondiente agregar unos 5 cm de profundidad de una solución acuosa de dextrosa al 55% y luego agregar cuidadosamente sobre la dextrosa en un centímetro de profundidad de un residuo digerido tripsínico; no mezclar, centrifugar a 20–25°C a 1200 g durante 30 minutos, aspirar y descartar todo el material líquido por encima del pellet.

  9. Resuspender el pellet en 2–4 volúmenes de agua, examinar microscópicamente para la detección de esporas.

* Solución pepsínica al 0,5%, pH 1,8 – 1,9 en HCl al 0,5%. Disolver 5 g de pepsina en polvo en 1000 ml de agua y agregar 5 ml de HCl concentrado. La solución puede refrigerarse hasta 1 mes o ser congelada.

** 0,25% de tripsina en la solución de Rinaldini. Hacer una pasta de 2,5 g de polvo de tripsina y solución de Rinaldini y luego diluir a 1 lt. Conservar congelada la solución de Rinaldini que es la siguiente:

HCl'8 g
C1K0,2 g
Citrato de sodio1,0 g
Fosfato sódico monobásico0,05 g
Bicarbonato de sodio1,0 g
Agua destilada (deionizada)1,0 lt
Glucosa1,0 g
Rojo fenol (solución acuosa al 1%)1,0 ml
6.3.1.2.2 Método de Inmunofluorescencia

En caso de que se detecten esporas de 7–10 um, indistinguibles de M. cerebralis, y las circunstancias merecen, una confirmación, deben ponerse en contacto con un Ictiopatólogo capacitado para identificar M. cerebralis para que confirme la patología de la enfermedad del torneo.

La identificación de M. cerebralis puede lograrse por la técnica directa de anticuerpos fluorescentes:

  1. Transferir la suspensión en estudio del paso (g) a un tubo de centrífuga y concentrar los residuos por centrifugado a 1200 g durante 10 minutos a la temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y ajustar la concentración de los residuos con agua a un volumen que permita una óptima observación de las esporas entre los residuos.

  2. Limpiar cuidadosamente un portaobjeto FAT (fluorescent antibody test) con detergente y agua deionizada, lavar bien y enjuagar bien con acetona, rotular una o más áreas circulares para M. cerebralis (control positivo) u otra espora (control negativo) u otro material (desconocido).

  3. Cubrir suavemente el portaobjeto con albúmina de huevo al 50%.

  4. Aplicar unas pequeñas gotas del material desconocido y de control a los puntos indicados en el portaobjeto y secarlo durante 15–20 minutos a 50–60°C, fijar con metanol durante 5 minutos y secar al aire.

  5. Aplicar suero de conejo anti-M. cerebralis conjugado con FTC (isotiocianato de fluoresceína) a cada prueba. Dejar actuar el suero durante 30–60 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

  6. Enjuagar el antisuero conjugado del portaobjeto con un tampón de pH 9–9,5 (bicarbonato de sodio 33,6 g, carbonato de sodio 10,6 g en 1 litro de agua). Sumergir cuidadosamente el portaobjeto en el tampón con agitación suave durante 5 minutos. Un lavado demasiado vigoroso o descuidado puede dar lugar a la pérdida de esporas.

  7. Sacar el portaobjeto y secar con sumo cuidado con papel de filtro limpio. Agregar 1 gota de aceite de inmersión a cada punto y examinar de × 1000 en un microscopio fluorescente.

  8. Detritos de cartílago y esporas pueden auto-fluorescer bajo luz ultravioleta. Esta fluorescencia es amarillenta. La identificación positiva de M. cerebralis se fundamenta en la detección de esporas y pre-esporas, las cuales fluorescen de un color verde manzana.

6.3.2 Técnicas para el diagnóstico de ceratomixosis

  1. Preparar preparados frescos de material a partir de la pared intestinal inferior o líquido ascítico si éste está presente. Debe examinarse también el contenido de la vesícula biliar o de cualquier lesión que esté presente en cualquier tejido. Usar microscopía óptica o de contraste de fase a un aumento de × 440 para un preparado fresco.

  2. Preparados frescos pueden colorearse por el método de:

    1. Zeihl-Neelsen pero sin calentamiento; mediante este método las cápsulas polares se colorean de rojo contra un fondo y de esporoplasmas azulados.

    2. Azul de metileno de Loeffler*; por un minuto se somete la muestra al colorante, luego se lava con agua destilada de pH 7,0 y se deja secar al aire. Los filamentos y cápsulas polares se tiñen de azul intenso y el esporoplasma se observa de azul ténue.

  3. Preparados permanentes pueden obtenerse de extendidos fijados con Schaudinn** y teñidos con hematoxilina férrica de Heidenhain.

  4. Examinar 25–30 campos, usando aumentos de × 440 para la detección de esporas.

* Azul de metileno de Loeffler:

Solución A
Azul de metileno300 mg
Alcohol etílico al 95%30 ml
Solución B
Solución de KOH al 0,01%
(peso/volumen 100 ml)
Mezclar las dos soluciones antes de efectuar la coloración.


** Fijador de Schaudinn

Solución saturada de mercurio clorhídrico66 ml
Alcohol de 95%33 ml
Acido acético glacial5 ml

6.3.3 Técnicas para la coloración de frotis sanguíneos

6.3.3.1 Técnica de Leishman

  1. Preparar un frotis con sangre fresca, sin uso de anticoagulante y secar al aire.

  2. Colocar el frotis con el colorante de Leishman*.

    Agregar 1 ml del colorante preparado, durante 1 minuto; luego agregar 1 ml de agua destilada tamponada a pH 6,8 al colorante ya colocado sobre el frotis, por 15 minutos; lavar cuidadosamente con el agua destilada tamponada.

  3. Dejar secar en el aire. Examinar con aceite de inmersión y un objetivo de × 100.

6.3.3.2 Técnica de Giemsa

  1. Preparar un frotis con sangre fresca sin uso de anticoagulante

  2. Fijar el frotis con metanol y secar al aire.

  3. Colorear con una solución de Giemsa**, en la siguiente proporción: 7,5 ml de colorante más 15 ml de agua tamponada a pH 6,8 durante 15 minutos. Lavar con agua corriente.

  4. Dejar secar en el aire. Examinar con aceite de inmersión y un objetivo de × 100.

* Colorante de Leishman

Colorante de Leishman en polvo0,15 g
Metanol libre de acetona100 ml


** Colorante de Giemsa

Eosina azul II3 g
Azul II800 mg
Glicerina250 ml
Alcohol metílico neutro (libre de acetona)250 ml

6.3.4 Técnicas para la coloración de protozoos

6.3.4.1 Método de Klein modificado (impregnación de plata para tri codínidos)

  1. Preparar frotis delgados tanto de piel como de las branquias en un portaobjeto bien limpio.

  2. Se deja secar al ambiente.

  3. Cubrir el portaobjeto con una solución acuosa al 2% de nitrato de plata durante 7 minutos. Para tricodínidos marinos o estuarinos se recomienda utilizar la solución a una temperatura de 4°C.

  4. Lavar con agua destilada o con agua de lluvia.

  5. Exponer el portaobjeto al sol entre 10–30 minutos según el espesor del frotis. Puede verse al microscopio a los 5 minutos. Se deja secar.

  6. Chequear las muestras al microscopio.

  7. Colocar la lámina en alcohol absoluto y después llevarlo a xilol.

  8. Montar con bálsamo de Canadá.

6.3.4.2 Técnicas para la fijación y coloración de helmintos

Como regla general los metazoos parasitarios pueden ser preservados para su posterior identificación en una solución fijadora que contenga 10 ml de formol, 20 ml de alcohol al 95% y 15 ml de agua; inmediatamente antes de usarse, se agregan 5 ml de ácido acético glacial a la solución fijadora. No obstante, se recomienda el empleo de las siguientes técnicas para la fijación y coloración de metazoos pertenecientes a diferentes clases:

6.3.4.2.1 Trematodos
6.3.4.2.1.1 Fijación de trematodos:

el parásito se lava cuidadosamente en suero fisiológico (solución acuosa al 0,85% de cloruro de sodio), y se prensa entre dos portaobjetos actuando con sumo cuidado para no destruir los órganos internos. Seguidamente se agrega por un costado solución formol-acético (50 ml de formol y 20 ml de ácido acético glacial en 930 ml de suero fisiológico), colocando en el costâdo opuesto un trozo de papel secante. Dejar actuar la solución fijadora durante 24–48 horas, conservando los parásitos fijados en solución formol-acético o en etanol al 70%.

6.3.4.2.1.2 Coloración de trematodos:

lavar los parásitos durante diez (10) minutos en agua corriente y después durante diez (10) minutos en agua destilada respectivamente. Transferir los parásitos a alcohol etílico al 70% durante veinte (20) minutos, y colocarlos en carmín clorhídrico alcohólico durante treinta (30) minutos a veinticuatro (24) horas, según su tamaño. Transferir al alcohol etílico al 70% durante diez (10) minutos, diferenciar en alcohol ácido por diez (10) minutos, y transferir los parásitos sucesivamente al alcohol etílico al 80%, al 90% y al 100% por diez (10) minutos respectivamente*. Efectuar la eliminación del alcohol mediante exposición en xilol, y proceder a montar los parásitos en bálsamo de Canadá neutro para su posterior estudio microscópico. El colorante carmín clorhídrico alcohólico tiene la siguiente composición:

Carmín5 ml
Acido clorhídrico5 ml
Agua destilada5 ml
Alcohol al 90%200 ml

6.3.4.3 Cestodos

La metodología para la fijación y coloración de los cestodos es la misma que se ha señalado en 6.3.4.2.1 arriba.

6.3.4.4 Nemátodos

Los nemátodos también pueden ser preservados en formol-acético o en alcohol etílico al 70%, procediendo a efectuar su coloración con carmín clorhídrico alcohólico tal como se ha detallado en 6.3.4.2.1 arriba.

6.3.4.5 Acantocéfalos

Al igual que los trematodos, los acantocéfalos se fijan y se colorean según lo detallado en 6.3.4.2.1 arriba.

Para la fijación de material destinado al estudio de protozoos, es aconsejable emplear el fluido de Schaudinn (véase 6.3.2).

Los exámenes parasitológicos propiamente dichos se llevan a cabo de conformidad con las técnicas que a continuación se detallan.

6.3.5 Piel y aletas

La superficie externa de la piel y de las aletas se estudia cuidadosamente, examinándolas con una lupa o con un microscopio de disección a fin de detectar la presencia de cualquier zooparásito (por ejemplo: anélidos, nemátodos, crustáceos, etc.). El mucus de la piel y de las aletas es cuidadosamente removido con un bisturí y montado con una gota de agua sobre un portaobjeto. Este preparado fresco se examina cuidadosamente para detectar la presencia de protozoos (por ejemplo: Ichthyobodo (según la nueva ubicación taxonómica) Chilodonella, Ichthyophthirius, Trichodina, etc) y de metazoos (por ejemplo: Argulus, Gyrodactylus, etc).

* Alcohol de 70% = 70 ml de alcohol al 95% + 25 ml de agua destilada
Alcohol de 80% = 80 ml de alcohol al 95% + 15 ml de agua destilada
Alcohol de 90% = 98 ml de alcohol al 95% + 5 ml de agua destilada
Alcohol ácido = 98 ml de alcohol al 95% + 2 ml de HCl

6.3.6 Branquias

Se remueve el opérculo y la superficie de las branquias es cuidadosamente examinado con una lupa o con un microscopio de disección para detectar cualquier parásito (por ejemplo: mixosporidios, trematodos, crustáceos, etc.). El arco branquial se separa con unas tijeras y las branquias se ponen en una cápsula de Petri junto con una pequeña cantidad de agua. El raspado del mucos se hace con un bisturí y se monta en una gota de agua sobre un portaobjeto. Los preparados frescos son examinados microscópicamente, usando los aumentos × 40 y × 100 para detectar la presencia de protozoos (por ejemplo: Ichthyobodo (según la nueva ubicación taxonómica), Chilodonella, Trichodina, etc.) y de metazoos (por ejemplo: Ergasilus, Tetraonchus, etc.).

6.3.7 Ojos

Los ojos de un salmónido que muestran señales clínicas de diplostomatosis son removidos in toto y colocados en una cápsula de Petri. Cada ojo se abre cortando con unas tijeras de punta fina y la lente se remueve. Las lentes y el humor vítreo son cuidadosamente examinados al microscopio para detectar la presencia de metacercarias de trematodos digenésicos.

6.3.8 Musculatura

Antes de examinar el tejido muscular en sí, se remueve la piel cuidadosamente y se examina el epitelio con el objeto de detectar la presencia de quistes de metacercarias de trematodos digenésicos, poniendo especial cuidado a aquellos de Neascus sp. y de Cryptocotyle lingua causantes de la “enfermedad del punto negro” en salmónidos procedentes de aguas dulces y saladas respectivamente. Se hace entonces una serie de cortes paralelos en el tejido muscular con un bisturí y el tejido se estudia aparte con ayuda de agujas de disección para exponer cualquier metacercaria enquistada, cestodo, nemátodo, etc.

6.3.9 Hígado

La superficie exterior del hígado se examina microscópicamente con el fin de detectar cualquier anormalidad obvia o zooparásito (por ejemplo: trematodos digenésicos, cestodos, nemátodos, etc.). Una pequeña porción del hígado se extrae y se monta en una gota de agua sobre un portaobjeto. Ese preparado fresco se examina microscópicamente, empleando los aumentos × 40 y × 100 para detectar mixosporidios o microsporidios.

6.3.10 Vesícula biliar

La vesícula biliar es cuidadosamente removida del hígado, y el contenido se examina microscópicamente para detectar la presencia de mixosporidios, especialmente de Ceratomyxa shasta - el cual es de importancia desde el punto de vista de la certificación ictiosanitaria. Es preciso que los salmónidos sean examinados e investigados en el laboratorio, y en forma regular, para detectar la presencia de esporas de C. shasta, y los correspondientes procedimientos biológicos se dan a conocer en el presente Manual en la sección “diagnóstico” de la ceratomixosis; estos procedimientos han de cumplirse al pie de la letra antes de poder efectuar cualquier envío de salmónidos al exterior, puesto que todo envío debe ser acompañado por un Certificado Ictiosanitario otorgado por un Inspector Ictiosanitario perteneciente al organismo gubernamental competente.

6.3.11 Tracto gastro-intestinal

Se remueve por entero el tracto gastro-intestinal después de haber cortado el esófago y el recto. El tracto está dividido en sus varias partes componentes principales (por ejemplo: esófago, estómago, intestino delgado, recto, etc.), cada una de las cuales se coloca separadamente en un recipiente apropiado con una pequeña cantidad de agua. La pared del órgano se corta longitudinalmente con unas tijeras, el contenido se remueve con un bisturí o con cualquier otro instrumento apropiado, y se examina con una lupa o con un microscopio de disección para detectar la presencia de cualquier protozoo o metazoo parasitario. Las paredes del órgano deberán ser cuidadosamente examinadas para detectar la presencia de cestodos enquistados y larvas de nemátodos. Es también importante que el contenido del recto sea examinado microscópicamente para detectar la presencia de Hexamita salmonis, agente etiológico de la hexamitiasis. Para los fines de la Certificación Ictiosanitaria, es necesario que los salmónidos sean examinados e investigados en el laboratorio y, en forma regular, para detectar la presencia de las esporas de C. shasta.

6.3.12 Cerebro y cápsula creaneana

Para los fines de la Certificación Ictiosanitaria, los términos de los Anexos Técnicos de la Convención Internacional FAO/OIE para Controlar la Propagación de las Principales Enfermedades Transmisibles de los Peces requieren que los salmónidos sean examinados e investigados en el laboratorio y, en forma regular, para detectar la presencia de las esporas Myxobolus cerebralis, agente etiológico de la enfermedad del torneo, en la cápsula creaneana. Los correspondientes procedimientos de laboratorio se detallan en el presente Manual en el renglón 6.3.1 arriba. Es de importancia fundamental que estos requisitos se cumplan al pie de la letra en lo que se refiere al diagnóstico de esta parasitosis antes de efctuarse cualquier envío de salmónidos en el comercio internacional, como así también que todo envío que llegue sea acompañado y amparado por un Certificado Ictiosanitario otorgado por un Inspector Ictiosanitario pertenciente al organismo gubernamental competente en el país de procedencia del envío.

6.3.13 Riñón

Como primer paso, se efectúa un examen macroscópico para detectar la presencia de cualquier anormalidad o parásito detectable a simple vista (por ejemplo: nemátodos, cestodos, trematodos digenésicos). Se toma un pequeño trozo del órgano para ser estudiado microscópicamente, poniendo de manifiesto la presencia de mixosporidios y sus esporas en el caso de hallarse presentes. Con una aguja de disección se procede a la exploración de las uretras para detectar trematodos digenésicos (por ejemplo: Phyllodistomum) u otros parásitos que pudiera haber en los mismos.

6.3.14 Bazo

Se efectúa un examen tanto macro como microscópico del órgano para detectar cualquier tipo de anormalidad y/o parásito en el mismo. El procedimiento a seguir en este estudio es el descrito anteriormente en el renglón 6.3.13 para el riñón.

6.3.15 Corazón

El corazón es removido in toto y cortado longitudinalmente. Una pequeña porción del órgano se monta en una gota de agua sobre un portaobjeto y el material es examinado microscópicamente como preparado fresco. Debe tenerse en cuenta que el corazón puede albergar trematodos digenésicos pertenecientes al género Sanguinicola.

6.3.16 Sangre

El examen de extendidos debidamente coloreados de la sangre es una operación importante en ictiopatología, por cuanto permite el reconocimiento de hemaflagelados, hemogregarinas y algunos nemátodos larvales. La sangre se obtiene por punción cardíaca y el extendido correspondiente se prepara lo antes posible para evitar problemas de coagulación. En la Sección 6.5 de este Manual se describen las técnicas para la obtención y coloración de sangre pisciaria.

En la TABLA 5 se detallan importantes caracteres para facilitar el reconocimiento de los principales grupos de zooparásitos en los salmónidos.

6.4 Exámenes histopatológicos

El propósito fundamental de los líquidos preservativos o fijadores es el de evitar autólisis y putrefacción, de solidificar material coloidal y convertirlo en un gel irreversible, de preservar los constituyentes celulares y tisulares de una manera natural, y de endurecer a los tejidos blandos (por ejemplo: el cerebro) con el fin de facilitar su manejo durante la disección.

Todo tejido u órgano debe ser removido cuanto antes y colocado en recipientes que contengan el preservativo deseado. El volumen líquido preservativo ha de ser en una proporción de 15–20:1 en relación al tejido u órgano correspondiente. El espesor ideal de tejidos u órganos destinados a estudios histopatológicos es de 3–5 mm, el cual permite que los procedimientos de fijación y manejo posterior se cumplan en un tiempo mínimo. Muestras enteras de peces deben ser preservadas con la pared abdominal previamente cortada, para así permitir la penetración del líquido preservativo en los órganos internos. Para muestras grandes, es generalmente más conveniente utilizar técnicas de inyección e inmersión.

La fijación cambia el índice de refracción de los tejidos y de sus componentes celulareŝ, haciéndolos más fácilmente visibles. La osmosis también juega un papel importante en el proceso de fijación y en casos cuando el líquido preservativo no es isotónico, las células experimentan distorsiones. Entre los líquidos preservativos compuestos se incluyen los de rutina tales como el formol, el líquido de Bouin, etc.

El formol es uno de los líquidos preservativos más usados, ya que tejidos u órganos pueden permanecer en el mismo durante largos períodos de tiempo sin experimentar endurecimiento excesivo. Sin embargo, y a veces, el mantenimiento de órganos o tejidos en formol durante mucho tiempo da lugar a la formación de un pigmento, el cual puede ser eliminado al tratarse el material con alcohol pícrico. También puede ser evitada esa pigmentación mediante la utilización de formol tamponado a un pH de 7,0 (pH neutro). El proceso de fijación en sí se completa dentro de las veinticuatro (24) horas, aunque muestras de mayor tamaño requieren períodos de tiempo más prolongados para su fijación completa. Material destinado para biopsias puede ser fijado en aproximadamente doce (12) horas, así como material que tenga menos de 3mm de espesor. Después de haberse fijado en formol, los tejidos están dotados de buenas propiedades de coloración. El formol preservativo tiene la siguiente composición:

Formol al 40% neutro10 ml
Cloruro de sodio0,9 g
Aguaad 100 ml

El líquido de Bouin permite una fijación rápida y uniforme, no merma a los tejidos y brinda excelentes propiedades de coloración (por ejemplo: hematoxilina - eosina, métodos tricrómicos). Es, por lo tanto, un líquido preservativo ideal para uso en ictiopatología, teniendo en cuenta que los procesos de autólisis y putrefacción tienen lugar más rápidamente en los peces que en material procedente de aves y mamíferos. El proceso de fijación generalmente queda completo dentro de las veinticuatro (24) horas, pero material destinado para biopsia (de un espesor de 2–3 mm) puede ser fijado en forma satisfactoria dentro de dos a tres (2–3) horas. Una vez terminado el proceso de fijación, los órganos o tejidos se colocan directamente en alcohol etílico al 60%. El líquido de Bouin tiene la siguiente composición:

Cloruro de mercurio5 g
Dicromato de potasio2,5 g
Sulfato de sodio1 g
Agua destiladaad 100 ml

Inmediatamente antes de usarse el líquido de Bouin, se agregan 5 ml de ácido acético glacial.

Siempre es conveniente que las muestras utilizadas para estudios histopatológicos sean peces vivos o moribundos. Material congelado carece de utilidad para histopatología, dado que los tejidos quedan distorsionados, alterados o destruidos.

El material preservado se incluye posteriormente en bloques de parafina, a partir de los cuales se procede a preparar los cortes histológicos con el micrótomo. Después de haberse efectuado los cortes y conforme a la metodología histológica normal, se suprime la parafina utilizando xilol y alcohol etílico de 100%, 90%, 70%, 50% y 30%, seguido por agua respectivamente. Posteriormente se procede a realizar la técnica de coloración correspondiente.

6.4.1 Técnicas de coloración en histología

A título de información, se detallan a continuación algunas de las técnicas más comúnmente usadas en la coloración de cortes histológicos de material pisciario.

6.4.1.1 Técnica de hematoxilina y eosina

Los cortes, de un espesor de 3–5 um, se colorean durante doce a quince (12–15) minutos con hematoxilina ácida de Ehrlich (o con hematoxilina de Delafield). Se colocan en agua destilada que contenga unas gotas de una solución acuosa de carbonato de litio (solución saturada) durante cinco a diez (5–10) minutos y se contracolorea en una solución acuosa de eosina al 0,2% durante un (1) minuto. Después de deshidratar y tratarse con xilol, los cortes se montan en bálsamo de Canadá neutro para su examen microscópico. Los núcleos se colorean azul oscuro y el citoplasma se colorea rojo rosado.

6.4.1.2 Técnica de coloración tricrómica de Mallory

Los cortes, de un espesor de 3–5 um, se colorean durante uno a cinco (1–5) minutos en fucsina ácida acuosa al 0,5%. Se elimina el colorante y se colocan durante veinte (20) minutos en una solución colorante que contenga 0,5 g de anilina hidrosoluble, 2 g de naranja G y 100 ml de ácido fosfotúngstico al 1%. Se lavan en alcohol etílico al 95%, hasta que no se desprende más colorante, se deshidratan y se tratan con xilol antes de montar los cortes en un bálsamo neutro. Las fibras colágenas se colorean de azul, las fibras elásticas se colorean de rosado o amarillo y los fibroblastos y neuroblastos se colorean de rojo.

6.4.1.3 Técnica de coloración de Van Gieson

Los cortes, de un espesor de 3–5 um, se colorean durante diez (10) minutos en hematoxilina de Harris. Después de haberse lavado con agua, se colocan durante diez (10) minutos en una solución colorante que contenga 7,5 ml de fucsina ácida acuosa al 1% y 50 ml de ácido pícrico acuoso saturado. Se lavan en alcohol etílico al 95%, se deshidratan y se tratan con xilol antes de montar en bálsamo de Canadá neutro. Los núcleos se colorean de azul-negro, los músculos de amarillo y las fibras de colágeno de rojo.

6.4.1.4 Técnica de coloración de Giemsa

Los cortes de un espesor de 3–5 um, se fijan en metanol neutro al 100% durante diez (10) minutos. Se secan en el aire hasta eliminar al metanol. Se colocan en una solución recién preparada de colorante de Giemsa diluida 1:10 con agua destilada con un pH de 6,6 – 6,8 durante diez a veinte (10–20) minutos. Se elimina el colorante y se lavan cuidadosamente los cortes en agua destilada. Se deshidratan, se tratan con xilol y se montan en un bálsamo de Canadá neutro. Esta técnica es de especial utilidad para poner de manifiesto la presencia de esporas de Myxobolus cerebralis, Ceratomyxa shasta y otros mixosporidios, así como también focos de bacterias en áreas necrotizadas de los tejidos.

6.5 Exámenes hematológicos

En la actualidad, se están utilizando cada vez más los exámenes hematológicos para complementar el diagnóstico de enfermedades infecto-contagiosas en operaciones de truchi- y salmonicultura, así como para controlar el estado fisiológico y nutricional de los peces, habiéndose comprobado plenamente el valor de estas pruebas en la práctica. Los métodos más comúnmente empleados son los que miden el nivel de hemoglobina, el hematocrito y el recuento eritrocitario respectivamente, además de estudios rutinarios sobre la morfología y distribución de los elementos celulares formados en la sangre periférica. Al no existir textos especializados sobre el tema de la hematología pisciaria, se ha estimado conveniente la inclusión en el presente Manual de los métodos detallados correspondientes para facilitar de esa manera la realización de exámenes hematológicos con respecto a los salmónidos.

6.5.1 Obtención de las muestras

6.5.1.1 Dedinos y ejemplares pequeños:

dado el reducido tamaño de dedinos y salmónidos juveniles, resulta difícil obtener cantidades suficientes de sangre como para permitir la realización de todos los exámenes hematológicos. Por ese motivo es generalmente suficiente preparar frotis sanguíneos y obtener una muestra de la sangre para determinar el hematocrito. La superficie del pez se seca cuidadosamente con una toalla de papel y se corta el pedúnculo caudal en la región posterior a las aletas adiposa y anal respectivamente. La sangre que brota se recolecta en un tubo capilar heparinizado para el hematocrito (ver 6.5.4) y una gota se coloca sobre un portaobjeto limpio para preparar el frotis (ver 6.5.6).

6.5.1.2 Ejemplares grandes y adultos:

la técnica más frecuentemente utilizada es la de la punción intracardíaca. El pez se coloca decúbito ventral y se introduce la aguja de una jeringa heparinizada en el ventrículo del corazón. Al aspirar la jeringa, se obtiene la cantidad de sangre deseada. Siempre es conveniente proceder a la preparación de los frotis sanguíneos en el momento de haberse efectuado la extracción. Debe tenerse en cuenta que la muestra consta de sangre venosa.

6.5.2 Hemoglobinometría

La determinación del contenido hemoglobínico de la sangre, o sea la hemoglobinometría, es de mucho valor en el diagnóstico de ciertas condiciones patológicas, así como indicador de la condición fisiológica y nutricional del pez. Las técnicas más precisas se fundamentan en la determinación de la capacidad oxigenadora, o bien en el contenido férrico de la sangre respectivamente. Sin embargo, estas técnicas de laboratorio son muy laboriosas y, por lo tanto, no se prestan para la práctica diaria de la piscifactoría ni del laboratorio ictiopatológico. Cualquier método de hemoglobinometría aplicado a la sangre pisciaria se complica a raíz del hecho que los eritrocitos son nucleados. Sin embargo, se ha demostrado que el método de cianmethemoglobina es una técnica bastante confiable para fines prácticos, dado que oxihemoglobina, carboxihemoglobina, methemoglobina y hemoglobina reducida se convierten en cianmethemoglobina, cuya concentración se mide colorimétricamente. Las hemoglobinas se oxidan por la acción de ferricianuro a methemoglobina, la cual queda convertida en cianmethemoglobina por la acción de cianuro.

Una cantidad de 20 mm3 (0,02 ml) de sangre total heparinizada y bien mezclada se obtiene con una pipeta de Sahli, llevando la columna de sangre un poco más arriba de la marca de la pipeta y luego expulsando cuidadosamente el exceso. Se limpia la parte exterior de la pipeta y se agrega la muestra sanguínea de 20 mm3 a un volumen exacto de 5 ml de solución de Drabkin en un recipiente de vidrio. La composición de la solución de Drabkin es la siguiente:

Bicarbonato de sodio1 g
Ferricianuro de potasio0,2 g
Cianuro de potasio0,2 g
Agua destiladaad 1000 ml

Se mezcla la sangre y el diluyente y se cierra el tubo con un tapón de caucho. El tubo se invierte varias veces para asegurar una buena mezcla de la sangre con el diluyente y la mezcla se deja a la temperatura ambiente durante por lo menos diez (10) minutos antes de efectuarse la lectura. Siempre que sea factible, deben efectuarse determinaciones en duplicado para cada muestra. La densidad óptica de la solución se mide a los 540 mu en un espectrofotómetro. El contenido hemoglobínico de la muestra se expresa de la manera convencional como Hb g 100 ml de sangre total. El resultado puede ser calculado en base a uno u otro de los siguientes métodos:

6.5.2.1 Patrón artificial:

el patrón es una solución de concentración conocida y cuya densidad óptica a los 540 mu corresponde a la de una cantidad determinada de Hb g 100 ml. Es aconsejable emplear patrones comerciales fidedignos para ese fin. La densidad óptica del patrón se determina a los 540 mu al agregar aproximadamente 5 ml a una cubeta y medirla con el espectrofotómetro. Seguidamente se determina la densidad óptica de cada muestra de sangre y el contenido hemoglobínico se calcula conforme a la siguiente fómula:



El patrón contiene aproximadamente 60 mg% de hemoglobina, pero la cifra precisa se da a conocer en cada ampolla.

Por ejemplo:

Densidad óptica de la muestra= 0,35
Densidad óptica del patrón= 0,41
Hb mg% del patrón= 60,0 (= 0,06 g%)


Para convertir esa cifra en Hb g 100 ml de sangre total, se emplea el factor de dilución:

Hb g% en la muestra x factor de dilución = Hb g 100 ml de sangre total

La muestra se diluye 1:251 (20 mm3 en 5 ml de diluyente), así que el resultado del ejemplo citado sería:

0,05 × 251 = 12,55 (o sea: 12,55 g Hb/100 ml de sangre total)

6.5.2.2 Curva standard:

es preferible utilizar una curva estándar para llevar a cabo la hemoglobinometría rutinaria de especies de salmones y truchas. Dichas curvas se preparan en base a estudios efectuados para determinar la densidad óptica de soluciones de cianmethemoglobina a los 540 mu frente a la concentración precisa de hemoglobina en g 100 ml determinada mediante técnicas de medición del contenido férrico en mg/100 ml (por ejemplo: el método de Wong). El contenido hemoglobínico se calcula en base a la fórmula 1 mg Fe% = 0,298 g Hb%. Es muy importante tener en cuenta la necesidad de elaborar curvas estándar distintas para salmónidos en aguas dulces y en aguas saladas respectivamente. Una vez elaborada la curva correspondiente, el contenido hemoglobínico puede determinarse directamente por extrapolación de la densidad óptica de la muestra.

6.5.3 Recuento eritrocitario

El fin perseguido por esta técnica es el de determinar correctamente el número de eritrocitos en la sangre periférica.

La muestra sanguínea se obtiene en un recipiente heparinizado y debe estar bien mezclada antes de efectuarse el recuento propiamente dicho. Se utiliza una pipeta cuenta-glóbulos de Thoma (con marca de ‘101’), con la cual se lleva la sangre hasta la marca ‘0,5’. La parte externa de la pipeta se limpia cuidadosamente y se ajusta la columna de sangre EXACTAMENTE en la línea ‘0,5’. Se llena la pipeta con suero fisiológico (solución acuosa de cloruro de sodio al 0,85%) hasta que la mezcla sangre-diluyente llega a la marca ‘101’. Tapando la pipeta con el pulgar y el dedo anular, se agita suavemente con la mano para asegurar una mezcla uniforme.

Una vez efectuada la mezcla y dilución de la sangre, se prepara una cámara cuenta-glóbulos de tipo Neubauer. La cámara en sí, como así también el cubreobjeto óptico correspondiente, se limpian cuidadosamente para librarlos de grasa y el cubreobjeto óptico se ajusta suavemente hasta que aparezcan los anillos de Newton en cada lado del pozo central.

Se agita otra vez la pipeta y se expulsa el primer tercio de su contenido. Una gota de la dilución se agrega a la cámara cuenta-glóbulos, dejándose correr por capilaridad hasta llenar la cámara. La cantidad de eritrocitos se enumera, de acuerdo a las técnicas hematológicas ya establecidas, en cinco (5) grupos de cuadros de la cámara cuenta-glóbulos. Para calcular el número de eritrocitos/mm3 de sangre total, se utiliza la siguiente fórmula, donde N representa el número de eritrocitos/mm3.



Esta fórmula se fundamenta en las consideraciones que a continuación se detallan:

Dilución de la sangre= 1:200
Profundidad de la cámara cuenta-glóbulos= 0,1 mm
Cada cuadro pequeño= 1/400 mm2
Número de cuadros pequeños contados= 80

En la praćtica rutinaria, es suficiente multiplicar × 10 000 el número total de eritrocitos en los cinco (5) grupos de pequeños cuadros.

Por ejemplo: número total de glóbulos rojos contados = 118



= 1,18×106/mm3

6.5.4 Hematocrito

El hematocrito es el volumen ocupado por los elementos celulares en 100 ml de sangre total. La técnica de determinación se fundamenta en la centrifugación de las células en una masa compacta, cuando la altura de la masa de células se expresa como un porcentaje de la altura total de la columna de células más plasma.

Es preferible llevar a cabo determinaciones del hematocrito con sangre heparinizada, para así no tener que aplicar un factor de corrección como sería el caso con sangre oxalatada o citratada. La muestra se obtiene en un tubo de microhematocrito heparinizado (disponibles en el comercio), asegurando la ausencia de burbujas de aire en la columna sanguínea. La altura de la columna debe ser de por lo menos 3 cm. Un lado l tubo se sella y el tubo se coloca en una centrífuga especial para microhematocritos. Se centrifuga durante cinco (5) minutos y se procede a leer el microhematocrito de cada muestra. Las células se compactan en tres capas, de las cuales la inferior es la que corresponde a los eritrocitos. Por encima de ellos quedan los leucocitos y los trombocitos, visibles en una capa delgada y de color blanco-grisáceo. Se ha de medir solamente la altura de la capa de eritrocitos. Debe observarse también el color del plasma, haciendo notar cualquier variación o desviación de su color amarillento pálido normal.

6.5.5 Indices hematológicos

Los índices hematológicos son de utilidad por cuanto dan información sobre ciertos caracteres de los eritrocitos, especialmente en el diagnóstico de casos de anemia. También es interesante señalar que el volumen corpuscular medio, por ejemplo, podría ser de valor en relación al tamaño de los eritrocitos cuando los salmónidos experimentan cambios fisiológicos tales como aclimatación a agua salada en la fase de esguín, migración hacia agua dulce para el desove, etc.

A los efectos de poder calcular los índices hematológicos, se requieren tres datos básicos, a saber: contenido hemoglobínico (Hb g 100 ml), recuento eritrocitario (× 106/m3) y hematocrito (%). Todos los valores citados son sujetos al error experimental y con el fin de asegurar que los índices hematológicos sean los más exactos posibles, es imperativo que los datos empleados hayan sido determinados con precisión.

6.5.5.1 Volumen corpuscular medio (V.C.M.)

el V.C.M. se expresa en micrones cúbicos (u3) y corresponde al volumen ocupado por un eritrocito medio. Se determina conforme a la siguiente fórmula:



Por ejemplo:

Hematocrito= 40%
Recuento eritrocitario= 1,1×106/mm3


6.5.5.2 Hemoglobina corpuscular media (H.C.M.):

la H.C.M. se expresa en micro-microgramos (uug) y equivale al peso de la hemoglobina en un eritrocito medio. Se determina conforme a la siguiente fórmula:



Por ejemplo:

Hb= 9,5 g/100 ml
Recuento eritrocitario= 1,1 × 106/mm3


6.5.5.3 Concentración corpuscular media de hemoglobina (C.C.M.H.):

la C.C.M.H. se expresa como el porcentaje de células (NO de sangre total) ocupado por la hemoglobina. Se determina conforme a la siguiente fórmula:



Por ejemplo:

Hb= 9,5 g/100 ml
Hematocrito= 40%


6.5.6 Preparación y coloración de frotis sanguíneos

El frotis debe ser preparado con sangre fresca, preferiblemente sin el uso de anticoagulantes (para lo cual hay que tener en cuenta que el tiempo de coagulación de la sangre de truchas y otros salmónidos es de alrededor de 10–20 segundos). Una gota (aproximadamente 10 mm3) de sangre se coloca a una distancia de 1,5 cm de la parte terminal de un portaobjeto limpio y libre de grasa. Con un segundo portaobjeto, mantenido en un ángulo de 45°, se procede a preparar un frotis delgado mediante un movimiento suave y cuidadoso que permite la extensión de la gota de sangre sobre la superficie del primer portaobjeto. Una vez preparado el frotis, se seca en el aire moviendo el portaobjeto cuidadosamente entre el pulgar y el dedo índice.

El frotis delgado puede ser coloreado por cualquiera de los métodos de Romanowsky, pero en la práctica es mejor la técnica de coloración de Leishman. Es preferible utilizar un colorante de Leishman ya preparado y disponible en el comercio; en el caso de que eso no sea factible, se prepara el colorante en el laboratorio al agregar una cantidad de 0,15 g del colorante de Leishman en polvo a 100 ml de metanol libre de acetona.

Se agrega una cantidad de 1 ml del colorante preparado a la superficie del frotis en posición horizontal, y se deja actuar durante un (1) minuto. Posteriormente, se agregan 2 ml de agua destilada tamponada a pH 6,8 al colorante ya colocado sobre el frotis, dejando actuar la mezcla de colorante - agua destilada durante quince (15) minutos. Se lava cuidadosamente con agua destilada tamponada (pH 6,8) para eliminar restos del colorante y se deja secar el preparado en el aire. Una vez seco, el frotis puede ser examinado microscópicamente utilizando aceite de inmersión y un objetivo X 100. Se procede a efectuar un cuidadoso examen de los elementos celulares formados, así como de la fórmula leucocitaria (o sea: el porcentaje de distribución de los granulocitos y linfocitos) según los procedimientos hemtalógicos establecidos.


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