Por:
Emilio Castro C. MSc.
Laura Avilia M. Quím.
Fundación Chile
Los aminoácidos son esenciales para la síntesis de proteínas en músculos, sangre y órganos del cuerpo. Sin aminoácidos no es posible la síntesis de proteinasí y la vida.
En nutrición acuícola, se utilizan variados ingredientes tales como: harina de pescado, tortas de leguminosas, afrechillo de trigo, aceite de pescado y otros para la formulación de los alimentos balanceados. El valor nutricional de estos insumos depende de su composición en carbohidratos, grasas, vitaminas, minerales y de un nutriente muy importante: La proteína.
Es bien conocido, que la calidad de la proteína de un alimento está determinada fundamentalmente por el tipo y cantidad de aminoácidos que la forman y por su digestibilidad.
Los ingredientes, se diferenician unos de otros, no sólo en el contenido de proteína bruta, sino también y de una forma sustancial en su composición de aminoácidos.
Los ingredientes de origen animal como por ejemplo la harina de pescado, se caracterizan por su excepcional contenido de lisina y aminoácidos azufrados, mientras que los insumos de origen vegetal y muy especialmente las tortas de soya se caracterizan por ser deficitarios en metionina y cistina.
La siguiente Tabla 6.1. ilustra los conceptos antes señalados:
| Materia prima | Harina pescado (65%) | Harina pescado (> 67.5%) | Torta soya | Cebada |
|---|---|---|---|---|
| Proteína bruta (%) | 65.00 | 67.74 | 45.90 | 11.10 |
| Lisina (%) | 5.07 | 5.58 | 2.88 | 0.43 |
| Metionina (%) | 1.91 | 2.00 | 0.63 | 0.20 |
Fuente: Fundación Chile, 1992.
El cuadro anterior, entre otras consideraciones, evidencia que el contenido de proteína bruta de una materia prima influencia directamente su aporte de aminoácidos. Sin embargo, desde el punto de vista nutricional, cobra mayor importancia el aminoácido que en esa proteína es el más limitante, ya que es el que determina la utilización de la proteína en la síntesis de la proteína corporal. El llamado “barril de Liebig”es una buena ilustración de este principio.
Los aminoácidos esenciales deben suministrarse necesariamente en la dieta, puesto que el organismo no puede sintetizarlos por si mismo.
Las especies salmonideas tienen un requerimiento de al menos 10 aminoácidos esenciales. Además, cada especie acuícola animal requiere una combinación de aminoácidos determinada. El requerimiento en aminoácidos no es una cantidad fija, sino que depende de la edad, sexo, variedad genética, nivel de rendimiento, etc…
La siguiente Tabla 6.2. muestra el requerimiento de aminoácidos esenciales para salmónidos.
| Aminoácido | % Dieta | % Proteína diaria |
|---|---|---|
| Arginina | 2.4 | 6.0 |
| Histidina | 0.7 | 1.8 |
| Isoleucina | 0.9 | 2.2 |
| Leucina | 1.6 | 3.9 |
| Lisina | 2.0 | 5.0 |
| Metionina (1) | 1.6 | 4.0 |
| Fenil alanina (2) | 2.1 | 6.0 |
| Treonina | 0.9 | 2.2 |
| Triptofano | 0.2 | 0.5 |
| Valina | 1.3 | 3.2 |
(1) Sin cisteina (2) Sin tirosina
Fuente: Hardy, 1988 (comunicación personal).
La siguiente Tabla 6.3. muestra el requerimiento de aminoácidos esenciales para especies distintas a los salmónidos.
| Arginina | Histidina | Isoleucina | Leucina | Valina | |
|---|---|---|---|---|---|
| Channel catfish | 4.3 | 1.5 | 2.6 | 3.5 | 3.0 |
| Tilapia | 4.0 | s/i | s/i | s/i | s/i |
| Carpa común | 4.3 | 2.1 | 2.5 | 3.3 | 3.6 |
Fuente: Wilson y Halver (1986)
El diagnóstico de deficiencias nutricionales causadas por una mal nutrición protéica o aminoacídica en especies acuícolas y animales, es muy difícil de diagnosticar como consecuencia del estado general de alteración que se evidencia en el animal. Frente a un problema nutricional de este tipo, los principales indicadores que muestra el animal son: un deterioro en la eficiencia de conversión, una reducción en la tasa de crecimiento y una mortalidad mucho mayor que la esperada. Es decir, todos muy inespecíficos. Sin embargo, diversos investigadores han informado de signos, más específicos que causarían en especies acuícolas, deficiencias nutricionales de ciertos aminoácidos en particular.
Las especies acuícolas presentan un elevado requerimiento nutricional de arginina, alrededor de un 6% de la proteína dietaria en salmónidos y 4 a 5% en otras especies de peces.
Ketola (1983), en ensayos de alimentación con alevines de truchas arco iris, realizados a nivel de laboratorio, observó una alta mortalidad y marcada erosión en la aleta caudal en los peces alimentados con dietas deficientes en lisina.
Anderson et al. (1991), por el contrario, en un ensayo destinado a determinar el requerimiento de lisina en alevines de salmón atlántico no observaron signos específicos de deficiencia nutricional durante los 140 días que duró este ensayo con una dieta deficiente en lisina. Si los peces deficientes evidenciaron un menor apetito, un menor ingesta de alimentos y por lo tanto, un menor crecimiento.
Diversos estudios han indicado que la metionina es esencial para el óptimo crecimiento de las especies acuícolas y que la presencia de cistina reduce el requirimiento de metionina dietaria necesaria para un óptimo crecimiento. En truchas arco iris se ha informado que dietas deficientes en metionina pueden causar cuadros caracterizados por cataratas bilaterales. Esta situación la observó Porton et al. (1977) al alimentar truchas cuya principal fuente de proteína era un aislado de soya. Bajo condiciones prácticas dietas con un mínimo de 25% de harina de pescado “especial” para la alimentación de especies acuícolas son más que suficientes para evitar esta situación.
Post (1983) ha señalado que dietas deficientes en triptofano son también capaces de causar deficiencias nutricionales caracterizadas por lordosis y escoliosis.
La determinación analítica de aminoácidos totales presenta las siguientes características:
Es lenta requiriendo como mínimo 2 a 3 días para una completa preparación de la muestra e hidrolisis de la proteína completa.
Es compleja, ya que:
La determinación de los aminoácidos azufrados demanda de un pretratamiento oxidativo con ácido fórmico previo a la hidrólisis ácida. Este pretratamiento tiene el propósito de convertir los aminoácidos sulfurados en derivados aminoacídicos estables.
La determinación del triptofano sólo es posible a través de una hidrólisis alcalina, ya que la hidrólisis ácida lo transforma en amonio afectando su estabilidad y la exactitud de la determinación.
Es de un alto costo ya que los tres procedimientos analíticos señalados anteriormente tienen un precio que fluctúa ente US$250 a 400, por muestra, en laboratorios comerciales.
Puede presentar tremendas variaciones en los valores que se determinen, debido a las diferencias metodológicas que existen en los distintos laboratorios. A modo de ejemplo señalaremos que algunos laboratorios utilizan un pretratamiento basado en una oxidación con ácido perfórmico mientras que otros laboratorios utilizan una hidrólisis directa con ácido bajo nitrógeno (Coon, 1993).
La deficiente consistencia que normalmente se obtienen en los valores de aminoácidos en muestras iguales, analizadas por distintos laboratorios frena las espectativas de los nutriólogos de utilizar esta información para optimizar la formulación de las dietas. No obstante lo anterior, significativos avances se han realizado en estos últimos años la determinación de aminoácidos en muestra biológicas incrementando su sensitividad, resolución, versatilidad y confiabilidad. Estos avances ha sido posibles gracias la gran desarrollo tecnológico que ha experimentado la cromatografía de intercambio iónico, de gas y en líquido de alta resolución, mejorando la presición y rapidez de estas determinaciones.
Si bien hasta hace poco tiempo este análisis era realizado en forma casi exclusiva por analizadores automáticos (autoanalizadores) de aminoácidos con el advenimiento de la cromatografía en fase líquida de alta resolución (HPLC) se han dado a conocer varias metodologías diferentes, para este propósito. Estas consideran derivatizaciones pre y post columnas. Los aminoácidos deben derivatizarse de manera de poder medirlos utilizando detectores corriente espectrofotométricos en la zona UV o fluorimétricos.
Un muestreo representativo y una adecuada preparación de la muestra (molienda, tamizado, desgrasado) son críticos ya que pueden constituir una importante fuente de error analítico.
El primer procedimiento involucrado o etapa que considera este análisis corresponde a una hidrólisis ácida a que se somete una cantidad exacta de 20 mg de proteína con 10 ml de HCl 6N durante 24 horas (University of Missouri, Columbia, 1985, Comunicación personal).
Los aminoácidos liberados con excepción de la metionina, cistina y triptofano son derivatizados y analizados por HPLC detectándose a 254 nm (Williams, 1988), o bien en un analizador automático de intercambio iónico (University of Missouri, Columbia, 1985, comunicación personal). El segundo procedimiento o etapa involucra la oxidación con ácido performico para determinar los aminoacidos azufrados: cistina y metionina. Para este efecto se recomienda pesar exactamente ±10 mg de proteína y agregarle 5 ml de ácido performico frío. Los aminoácidos azufrados liberados se pueden analizar en el mismo analizador automático de intercambio iónico señalado anteriormente.
Finalmente, la tercera etapa corresponde a la determinación del triptofano involucra una hidrólisis alcalina con NaOH 6M a 110°C por 20 horas (Williams, 1988). Para cada uno de estos procedimientos existen factores críticos a considerar con el fin de lograr resultados válidos y consistentes.
De los distintos métodos analíticos publicados para la determinación de los aminoácidos más limitantes (lisina, metionina, cistina) para dietas acuícolas y animales, analizaremos a modo ilustrativo el publicado recientemente por Cubedo Fernández (1990) en el J. Assoc. Off. Anal. Chem. Este método, se basa en realizar una derivación de los aminoácidos en precolumna con 9-fluorenilmetil cloroformato (9-FMC) y su cuantificación por cromatografía liquida en fase reversa. Para este propósito se procede básicamente de la siguiente forma:
Pese 25 mg de la proteína cruda de la muestra problema molida finamente.
Tome y pese una porción de la muestra anterior y sométala a oxidación con ácido perfórmico durante 16 horas previo a su hidrólisis con HCl 6N por 24 horas.
Derivatice con 9-FMC una alicuota de cada una de las soluciones anteriores.
Analice por cromatografía líquida en fase reversa una alicuota de las soluciones provenientes de las hidrólisis anteriores, utilizando un detector de fluorescencia con un filtro de exitación de 254 mm y un filtro de emisión de 313 mm.
La lisina, metionina y cistina son cuantificadas utilizando calibración de standards internos calibrados.
La precisión de este método ha sido evaluado en un hidrolizado simple y entre diferentes hidrolizados de una misma muestra encontrándose que el coeficiente de variación no fue superior a 4.1 y 5.9% respectivamente.
Esta determinación analítica de gran utilidad ya que determina el grado de deterioro térmico sufrido por las proteínas y por ende la disponibilidad biológica de las mismas. Presenta las siguientes características:
| Método: | Carpenter (1960) |
| Objetivo: | evaluar la disponibilidad de los aminoácidos a través de la determinación química de la lisina disponible. |
| Principio del método: | determinación de lisina reactiva por reacción de grupos NH2 provenientes de la lisina, con FDNB (fluordinitrobenceno) y posterior cuantificación espectrofotométrica previa hidrólisis ácida por formación de dinitro fenil lisina. |
Etapas:
| Preparación de la muestra: molienda original. |
| ↓ |
| Molienda y tamizaje (ASTM malla #40). |
| ↓ |
| Pesada de precisión: 0.1 mg (balanza analítica). |
| ↓ |
| Procedimiento/reacción: suspensión en solución de NaHCO3 10'. |
| ↓ |
| Adición de solución de FDNB en etanol y agitación por 2 horas. |
| ↓ |
| Evaporación del etanol. |
| ↓ |
| Hidrólisis ácida por 16 horas. |
| ↓ |
| Filtrar, lavar, aforar. |
| ↓ |
| Dilución 10 ml filtrado/50 ml con ácido clorhídrico 1N. |
Tomar una alicuota de 2 ml y colocarla en 3 tubos: El primer tubo corresponde al blanco, el segundo tubo a la muestra y el tercer tubo sirve para saber la cantidad de hidróxido de sodio necesaria a agregar para neutralizar la reacción en el blanco (ver esquema de la página siguiente).
La determinación implica que debe realizarse una determinación de lisina disponible en paralelo para una muestra standard.
Cálculo:
| Lisina disponible (g/100 g Proteína): |  |
| Donde: | ||
| Am | : | Absorbancia neta muestra |
| As | : | Absorbancia neta standard |
| g | : | Peso muestra, g |
| %P | : | % Proteína en muestra (Kjeldahl) |
| F | : | Factor de dilución, incluyendo contenido de lisina en standard. |
| 1.09 | : | Factor de corrección por pérdida teórica de DNP-Lisina durante proceso de hidrólisis ácida. Se estima en un 8% (factor no aplicable a muestras de origen vegetal) |
Permite evaluar la disponibilidad de los aminoácidos y consiguientemente el potencial daño térmico y/o calidad de procesamiento industrial a que fue sometida la proteína (valores ≥7.4% son aceptables en harinas de pescado adecuadamente procesadas).
Es de bajo costo analítico en relación a bioensayos.
Constituye una alternativa frente a pruebas de biodisponibilidad de aminoácidos realizados con bioensayos que en general presentan una gran impresición, son caros y demoran un largo tiempo.
Durante la hidrólisis ácida algo del compuesto dinitrofenil lisina se destruye y es necesario aplicar un factor de corrección igual a 1.09 (Carpenter, 1960).
La reacción del FDNB con la lisina reactiva no es específica.
AOAC Official Methods of Analysis (1984). Lysine (Available) in Nutritional Supplements. Automated Method. p. 882.
Barlow, S.M. et al., 1984. Procedimientos químicos y biológicos para la determinación de lisina en harinas de pescado. IAFMM. Boletín Técnico No20. p.4.
Coon, C.N., 1993. Optimizing ingredient utilization through a better understanding of aminoacid bioavailability. p. 11–15 in Novus. Proceedings of the 1991 Technical Symposia.
Cubedo Fernández, A., 1990. Quantitative Analysis of Methionine, Cysteine and Lysine in Feeds by Reserve phase Liquid Chromatography Using Precolumn Derivatitization with 9-Fluorenylmethyl Cloroformate. J. Assoc. Off. Anal. Chem. (Vol. 73, No6, 935–939)
Gehrke, C.W. et al., 1985. Sample Preparation for Chromatography of Aminoacids: Acid Hydrolisis of Proteins. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68 (5): 811–821.
Hardy, R.W, 1988. Nutrients requirements of farmed salmon. School of Fisheries. University of Washington. (Comunicación personal)
Merck Informa No26 1991. Determinación cuantitativa de la composición aminoacídica de proteínas de harinas de pescado. p. 2–5.
University of Missouri, Columbia, 1985. Aminoacid Analysis - Protein Hydrolisis. (Comunicación personal)
Wilson, P., 1986. Protein and Aminoacid Requirements of Fish. Ann. Rev. Nutr. 1986. 6:225-44.
