Les mycoplasmes ont besoin, dans leur milieur de culture, de stérols qu'ils incorporent dans leur membrane cytoplasmique. Le cholestérol, en particulier, joue un rôle clé dans la synthèse et le maintien de l'intégrité des membranes cellulaires des mycoplasmes. Le cholestérol est habituellement fourni par le sérum animal qui est ajouté au milieu de culture des mycoplasmes. Les acholéplasmes sont capables de synthétiser les stérols eux-mêmes et peuvent donc se multiplier dans les milieux auxquels on n'a pas ajouté de sources de stérols tels que le sérum d'origine animale. La digitonine provoque une lyse des cellules des mycoplasmes par la formation de précipités de complexes digitonine-cholestérol qui rendent plus perméables les membranes cellulaires des mycoplasmes. Cette perméabilité accrue de la membrane finit par provoquer la mort du mycoplasme. Par conséquent, croissance des colonies de mycoplasmes sur gélose est inhibée par la digitonine tandis que les acholéplasmes ne sont pas touchés. Cette caractéristique différentielle peut donc être utilisée pour détecter toute contamination des vaccins contre la péripneumonie contagieuse bovine par les acholéplasmes.
I. Matériel
- Hotte à flux laminaire de classe II
- Flacons (30 ml)
- Pipettes stériles, 5 et 10 ml
- Pipetteur de 5 à 30 m l; 40 à 200 m l et embouts
- Incubateur, réglé à 37±0.5°C
- Boîte de Pétri 60 x 15 mm
- Aiguilles N° 18
- Pince à tissus stérile
- Boîte humide
II. Réactifs
- Disques à la digitonine (MOS 1)
- Gélose pour mycoplasmes (MOS 1)
- Vaccin contre la péripneumonie contagieuse bovine
III. Mode opératoire
1. Reconstituer un flacon de vaccin contre la péripneumonie contagieuse bovine en utilisant un volume d'eau distillée stérile froide égal au volume de remplissage du flacon de vaccin. Conserver le vaccin à 4°C.2. Sécher la plaque de gélose ensemencée aux mycoplasmes précédemment préparée (munie d'un couvercle) en la maintenant à 37°C pendant deux heures.
3. En prenant la suspension non diluée de vaccin reconstitué, préparer des dilutions décimales en utilisant de l'eau distillée stérile, du tampon phosphate ou une base du milieu de numération de manière à obtenir une concentration de mycoplasmes de l'ordre de 106 (1 million). Pour la plupart des vaccins contre la péripneumonie contagieuse bovine testés au PANVAC, cela correspondait à une dilution de 10'3. A l'aide de 150 m l de vaccin dilué de manière appropriée, ensemencer en nappe uniformément la plaque de milieu gélose.
4. Placer un disque de digitonine sur la surface de la gélose ensemencée tout en pressant légèrement dessus.
5. Avec le couvercle en place, faire sécher la boite de gélose en la laissant pendant une heure sous une hotte à flux laminaire.
6. Mettre la boite de gélose en position renversée dans une chambre humide qui est ensuite placée à 37°C.
7. Examiner la boite de gélose, le troisième, le sixième et le dixième jours sous un objectif 16x de microscope inversé pour observer la zone et l'étendue de la zone d'inhibition de croissance des mycoplasmes tout autour des disques de digitonine. Noter les observations.
IV. Interprétation des observations
Le vaccin passe l'épreuve de la sensibilité à la digitonine si on observe une zone d'inhibition de la croissance des mycoplasmes mesurant au moins 5 mm à partir du bord du disque de digitonine. S'il y a une pénétration de colonies dans la zone d'inhibition, on peut suspecter une contamination par les acholéplasmes et/ou par des bactéries et le vaccin ne passe pas le test de sensibilité à la digitonine. Les colonies en question doivent être clonées et identifiées.
