XI CONGRES FORESTIER
MONDIAL
13- 22 Octobre
1997, Antalya, Turquie
  VOLUME 8E. COMPOSITIONS DES ETUDIANTS
Croisements interspécifiques sur des Eucalyptus Sp.Victor O. Botto 1 Dans le cadre d'une stratégie d'amélioration génétique du genre Eucalyptus pour la région de la Pampa (province de Buenos Aires et sud de la province de Santa Fé, en Argentine) les croisements contrôlés constituent un instrument précieux permettant d'obtenir d'importants bénéfices génétiques. C'est pour cette raison qu'on décrit dans cet article les techniques d'extraction, de conservation et d'évaluation du pollen, ainsi que la technique utilisée pour les croisements contrôlés. C'est ainsi qu'on a réalisé environ 1 800 castrations de fleurs sur des matrices de clones d'Eucalyptus dunnii, qu'on a pollinisées avec du pollen d'Eucalyptus grandis, Eucalyptus viminalis et 11 lots de pollen d'Eucalyptus globulus importés du Portugal grâce à la convention passée entre l'Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria (INTA) d'Argentine et la Sociedade Portuguesa de Celulosa (SOPORCEL). Les résultats obtenus jusqu'à présent sont plus que prometteurs, puisqu'on a obtenu un pourcentage général de formation de capsules de l'ordre de 60% pour l'ensemble des croisements réalisés. En outre, on a observé des différences entre les matrices, certaines présentant un grand taux de fertilité. Mots clés : concours pour étudiants, ressources génétiques forestières. INTRODUCTION Les croisements interspécifiques constituent un des instruments disponibles pour les programmes d'amélioration génétique car ils permettent de créer de nouvelles combinaisons de gènes, qui, autrement, n'existeraient pas dans la nature (van Wyk, 1987) et qui autorisent à réunir, dans un seul individu, une ou plusieurs caractéristiques intéressantes qui se trouvent chez les parents. Lorsque deux spécimens d'espèces différentes sont croisés, la F1 peut manifester une certaine vigueur hybride, raison pour laquelle elle sera utilisée dans des programmes d'amélioration. Il est important, lorsqu'on projette de réaliser un croisement entre deux espèces, d'évaluer sa faisabilité en fonction de l'affinité systématique existant entre les deux. La situation des espèces dans la classification de Pryor et Johnson (FAO 1981) est un indice utile de la capacité d'hybridation. Selon cette classification, les croisements sont possibles à l'intérieur d'un même sous-genre. Cependant, il y a trois exceptions avec le sous-genre Symphyomyrtus. Les sections Adnataria, Dumaria et Equatoria ne s'hybrident pas avec d'autres sections du sous-genre Symphyomyrtus, mais seulement entre elles. Les croisements dans ce même sous-genre et entre d'autres sections de celui-ci sont possibles et fréquentes, aussi bien à l'état naturel qu'en laboratoire. Si on analyse les espèces qui ont présenté un bon comportement pour la région de la Pampa, enArgentine (Alliani, R., 1990), on observe que la plupart de celles-ci appartient au sous-genre Symphyomyrtus, raison pour laquelle les croisements sont possibles entre elles. L'objectif de ce travail est tout d'abord la formation et l'entraînement aux techniques de pollinisation contrôlée avec le matériel disponible à l'INTA Castelar, pour ensuite franchir une première étape vers l'obtention d'hybrides intéressants pour la région de la Pampa, par exemple en croisant des Eucalyptus dunnii avec des E. globulus ssp globulus, spécimens dans lesquels on espère réunir les caractéristiques de résistance aux gelées et aux canicules estivales que présente l'Eucalyptus dunnii et la qualité de pâte à papier que permet l'Eucalyptus globulus. L'obtention d'hybrides réunissant ces caractéristiques permettrait l'élargissement de la limite actuelle de la culture de l'Eucalyptus globulus ssp globulus, située dans le littoral sud-est de la province de Buenos Aires, en Argentine, vers l'intérieur des terres. MATERIEL ET METHODES Observations phénologiques Pour l'élaboration d'un programme efficace d'hybridation interspécifique, il est indispensable de connaître parfaitement la biologie florale des espèces considérées (van Wyk, 1987). Un exemple en est donné par les travaux de Hodgson (1976) sur l'Eucalyptus grandis en Afrique du Sud, Griffin et Hand (1979) sur l'Eucalyptus regnans en Australie et Cauvin (1983) sur l'Eucalyptus dunnii et l'Eucalyptus viminalis. Normalement, lorsqu'on cultive une espèce en dehors de son habitat naturel, comme c'est le cas des Eucalyptus, il se produit des dérèglements dans la floraison, aussi bien ponctuellement que durablement. Pour cette raison, ne disposant pas de données phénologiques pour notre région, il s'est révélé indispensable de réaliser tout d'abord une étude phénologique des espèces intéressantes, dans le but de déterminer le moment de chacune des phases phénologiques. A cet effet, on a observé le cycle floral sur 36 spécimens des espèces suivantes : Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus dunnii, Eucalyptus saligna, Eucalyptus globulus ssp globulus et Eucalyptus viminalis poussant sur des parcelles témoin et, d'autre part, sur un choix d'espèces plantées à l'INTA Castelar. Les observations, effectuées tous les quinze jours, sur une période de deux ans, consistaient à relever, pour chacun des spécimens observés, la présence des phases suivantes : bourgeonnement, anthèse, fructification et déhiscence des fruits. Dans le tableau 1 ci-après, sont présentées les différentes phases phénologiques pour chacune des espèces étudiées. On observera que le cycle complet, du bourgeonnement à la maturation du fruit, dure plus d'un an, raison pour laquelle, à certaines époques de l'année, se superposent des phases relevant de différents cycles. Cette superposition se produit dans toutes les espèces observées, mais avec des différences quant à la durée et à l'apparition de chaque phase. 2 Extraction et conservation du pollen Pour l'extraction du pollen, on a recouru à la technique décrite par Rocha et Gea (1988), qui veut qu'on coupe des branches portant des fleurs ouvertes et des bourgeons dont la chute imminente de l'opercule est visible au changement de la coloration de celui-ci, qui passe alors du vert au jaune. Ces branches sont conditionnées en en retirant les fleurs déjà ouvertes, pour éviter la contaminationpar du pollen étranger, et en coupant 50% des feuilles, pour diminuer la transpiration. Les branches sont placées dans un récipient de façon à ce que leur base, coupée en biseau pour augmenter la surface d'absorption, reste plongée dans l'eau. On les laisse ainsi, à une température adéquate, de 25 à 30°C, et le processus de floraison se poursuit normalement. Une fois réalisée l'anthèse, les fleurs sont coupées par le pédicelle et plongées pendant cinq minutes dans du tétrachlorure de carbone, de sorte qu'on puisse visualiser la dispersion du pollen dans la solution. Une fois la solution filtrée, et après évaporation du tétrachlorure de carbone, le résidu adhérant au papier du filtre est transvasé dans des tubes à essai, à l'aide d'un pinceau à poils fins. Estimant cette technique trop lente et compliquée, on l'a modifiée selon la méthode décrite par Espejo (1993), qui consiste, une fois que s'est produite l'expansion complète des étamines, à couper les anthères et à les déposer dans des boîtes de Pétri, qui sont entreposées dans un dessiccateur à gel de silice pendant 48 à 72 heures. Après la dessiccation, les anthères sont passées au tamis (de 500 µm) pour séparer le pollen des débris d'anthères et des filaments. Le pollen est conservé dans des capsules de gélatine "0", lesquelles sont stockées dans des flacons avec du gel de silice. On les conserve à 4°C si on doit s'en servir dans les quelques semaines à suivre, ou à une température de - 15°C sinon. Il faut souligner l'importance cruciale que revêt le processus de dessiccation, dont dépend la bonne conservation du pollen, car en congelant des matériaux à haut contenu d'humidité, les cristaux de glace qui se forment, en modifiant les structures cellulaires, altèrent sérieusement la viabilité du pollen. Viabilité du pollen L'évaluation de la viabilité du pollen doit être réalisée après qu'il ait été stocké pendant de longues périodes, pour s'assurer que le matériel utilisé dans les croisements contrôlés présente un pourcentage acceptable de germination. Selon Pryor (1976) la viabilité du pollen peut être évaluée in vitro en plaçant un petit échantillon de pollen sur une plaque de gélose avec une dose appropriée de saccharose et en le mettant à incuber à 23°C. Brune, cité par van Wyk (1987), a découvert que le milieu produisant les meilleurs résultats était composé de 1,5% de gélose, 35% de saccharose et 100 à 250 mg/kg d'acide borique. Une description détaillée des tests de viabilité a été présentée par Boden (1958), qui a employé la méthode de la goutte suspendue. Il a trouvé que le milieu produisant les meilleurs résultats contenait 1,5% de gélatine et quelque 20% de saccharose. La germination se produit à une température de 20 à 30°C. Boden adopte une température d'incubation de 30°C et observe la germination après 6 heures. Griffin (1982), qui trouvait difficile la méthode de la goutte suspendue, a utilisé un milieu contenant simplement une solution à 30% de saccharose et 1,5 mg/kg d'acide borique, avec une durée d'incubation de 24 heures à 30°C. On a utilisé, au cours ce travail, le test de viabilité recommandé par Schenone, R. (communication personnelle) selon lequel on détermine la germination du pollen dans une solution à 15% de saccharose et 300 mg/kg d'acide borique, après une période d'incubation de 2 à 4 jours à une température de 28 à 30°C. Au-dessous des températures mentionnées, le processus de germination peut prendre jusqu'à deux fois plus de temps. Une fois écoulé le temps d'incubation, on place une goutte du milieu de culture sur un porte-objet et on l'observe au microscope. On considère que le pollen germe non seulement si les grains présentent un tube pollinique, mais encore si les grains changent de forme et présentent un aspect presque triangulaire, avec les angles dilatés. Croisements contrôlés La technique de pollinisation contrôlée a été décrite en détail par Hodgson (1976) et van Wyk (1977) et ultérieurement adaptée par Campinhos au Brésil (Martin, 1987) et par Bouvet (1982) au Congo. Si la technique est simple, la hauteur à laquelle se trouvent les fleurs, surtout sur les arbres sélectionnés, rend pratiquement impossible son exécution dans des conditions normales de plantation. Pour pallier cet inconvénient opératoire, il faut constituer un parc d'hybridation (Martin, 1987 ; Cauvin, 1983). Signalons à ce sujet qu'à l'INTA Castelar se trouve installé un parc de ce genre, où sont plantés, à une distance de 4 mètres sur 3, 15 clones d'Eucalyptus dunnii de 5 ans d'âge, obtenus par greffage, selon la technique décrite par López, Alliani, Gea (1990), d'arbres sélectionnés non seulement pour leurs caractéristiques de croissance et de morphologie, mais aussi pour la précocité de leur floraison. Les arbres proviennent d'une plantation commerciale connue : celle d'Urbenville (VIC), située à Oliveros, dans le province de Santa Fé, en Argentine. Pour éviter un amoindrissement de la floraison dû à des manifestations de vigueur juvénile chez les eucalyptus greffés et afin de favoriser la formation de nouveaux bourgeons floraux, on a suivi la technique développée par Cauvin (1983) en France, suivant laquelle on a arqué et dirigé les branches des greffons de manière à provoquer une floraison plus abondante et à obtenir une disposition des branches qui facilite le travail de pollinisation. En outre, les porte-greffes ont subi une taille de leur tige principale afin de maintenir les arbres bas et de favoriser l'apparition de pousses, de manière à obtenir une floraison continue. En outre, les branches sont disposées dans l'espace de manière à faciliter le travail. On espère pouvoir poursuivre cette technique, afin de disposer de matériel apte aux croisements tous les ans. Le programme de croisements contrôlés réalisé (voir le Tableau 2) a consisté à prendre comme matrices ou mères les clones d'Eucalyptus dunnii, sur lesquels on a pollinisé les fleurs avec du pollen d'Eucalyptus grandis d'origine Kendall et de pépinière (province argentine de Concordia), d'Eucalyptus viminalis d'origine Warburton et 11 lots de pollen d'Eucalyptus globulus ssp globulus provenant de spécimens sélectionnés, importés du Portugal grâce à la convention internationale d'assistance technique passée entre l'INTA et la Sociedade Portuguesa de Celulosa (SOPORCEL). Le processus de pollinisation contrôlée proprement dit comporte deux étapes : l'émasculation ou extraction des structures masculines sur les pieds qui servent de mère et, d'autre part, la pollinisation, qui consiste à réaliser le transfert du pollen dans la structure féminine par des méthodes artificielles (Espejo, 1993). Pour l'émasculation et l'isolation, on a sélectionné les branches qui présentaient des inflorescences avec des fleurs en état de pré-anthèse, ou présence de fleurs légèrement ouvertes. En premier lieu, on a éliminé les fleurs qui se trouvaient déjà ouvertes, afin d'éviter la contamination par un pollen non désiré. Puis on a procédé à l'émasculation des fleurs fermées, ce qui consiste à en retirer l'opercule et les étamines, pour éviter l'autofécondation. Cette opération est réalisée avec un instrument tranchant, en pratiquant une incision périmétrique au-dessous de l'anneau du calice, puis en ôtant les étamines restantes, ou qui sont repliées dans l'hypanthe.
Une fois émasculées, les fleurs doivent être isolées pour éviter la contamination par un pollen étranger. A cette fin, elles sont recouvertes d'une enveloppe de toile synthétique, avec comme support une spirale de fil de fer qu'on attache à la branche par un brin de fil, en prenant la précaution de placer un morceau de coton entre la branche et le fil de fer, pour éviter que les tissus ne soient abîmés par le frottement. Le matériau utilisé pour la confection de ces poches doit être léger, non absorbant, et sa trame doit être suffisamment serrée pour éviter la contamination des stigmates par du pollen non désiré, mais il faut que l'air et la lumière puissent passer. On doit particulièrement prendre garde à ce que les stigmates ne soient pas en contact avec la poche ou avec le fil de fer, car cela entraînerait leur chute. La pollinisation proprement dite : 10 à 15 jours après l'émasculation et l'isolation des fleurs, les structures féminines présentent leur réceptivité maximale, rendue manifeste par l'élongation des styles, l'épaississement des stigmates et la sécrétion d'une substance poisseuse, qui non seulement fait adhérer le pollen mais constitue également un milieu favorable à sa germination. Ensuite, et au moment où on observe la réceptivité maximale des stigmates, on procède à la pollinisation à l'aide d'un pinceau à poils fins, en prenant la précaution d'utiliser un pinceau différent pour chaque combinaison parentale, évitant ainsi la contamination qui peut se produire si du pollen demeure entre les poils d'un pinceau ayant déjà servi. Compte tenu que, pour les espèces du sous-genre Symphyomyrtus, ce qui est le cas des nôtres, les stigmates restent réceptifs pendant une période variant de 4 à 10 jours (Hodgson, 1976), la pollinisation a été répétée à quatre ou cinq reprises, à intervalles de trois jours, pour tâcher d'assurer la fertilisation. Au bout de 30 à 40 jours, quand la période de pollinisation est terminée et qu'a lieu la chute des styles, symptôme certain de la perte de réceptivité, on ôte les enveloppes qui ont servi à l'isolation, pour éviter que les branches ne s'abîment et pour favoriser le développement des capsules. Comme le développement des fruits jusqu'à complète maturation est long, et varie selon les espèces jusqu'à plus d'un an, il faut procéder à l'étiquetage des branches où se trouvent les fleurs pollinisées, afin de permettre le suivi de la maturation, et d'éviter de confondre ou de perdre des fleurs. Résultats et conclusions On observe des différences entre clones quant au pourcentage de formation de fruits (Tableau 3). Parmi eux se signalent les clones ED2, ED3, ED5, ED6 et ED7 (Eucalyptus dunnii), qui présentent pour plusieurs de leurs croisements des taux de réussite de 100% ou s'en approchant. La bonne fertilité de ces pieds s'observe non seulement dans les croisements avec des Eucalyptus globulus, mais aussi dans ceux réalisés avec les Eucalyptus viminalis et Eucalyptus grandis. Il est également important de souligner que le pourcentage général de formation de capsules est élevé (presque 60%). Les taux de formation de capsules sur chacun des clones qui ont servi comme mères sont plus qu'encourageants, si on considère que c'est la première expérience menée dans ce domaine.
références : ED= E. dunnii ; EGl.= E. globulus ; EV= E. viminalis ; EGr.= E. grandis Dans tous les cas, il est important de réaliser les croisements réciproques, vu qu'il existe des antécédents de vigueur hybride différentielle (Venkatesh et Sharma, 1977). Mais dans le cas des croisements avec du pollen d'Eucalyptus globulus, cela n'est pas possible, parce que les espèces utilisées pour les croisements ont des fleurs plus petites et que l'élongation du tube pollinique des petites fleurs est inférieure à la longueur du style de l'Eucalyptus globulus, ce qui est une cause d'incompatibilité unilatérale de croisement. Quant au nombre de graines qu'on peut attendre par capsule, il est variable, selon la bibliographie consultée (Griffin, 1982 ; Hodgson, 1975 ; van Wyk, 1987) et dépend presque toujours du moment de floraison de la mère, du moment de réceptivité des stigmates et du procédé de conservation du pollen, qui réduit sa viabilité. La sélection ultérieure des hybrides obtenus doit être accompagnée d'une technologie adaptée de propagation végétative, afin de fixer l'important bénéfice génétique qui se produit lorsque des spécimens distincts sont croisés. On assiste, ce qui peut sembler paradoxal, à un rétrécissement de la base génétique. Pour minimiser cet effet, les pères intervenant dans un programme de croisements contrôlés doivent provenir d'un autre type d'amélioration, ce qui permettra de préserver la diversité génétique. REMERCIEMENTS L'auteur remercie Gustavo López, ingénieur forestier, et Javier Rodríguez Traverso, ingénieur agronome de l'Instituto de Recursos Biológicos (INTA Castelar) pour leurs conseils au cours de la réalisation de l'expérience et pour la correction du présent article, ainsi que ses camarades d'étude Juan Manuel Crespo Montes, Flavia Mattio, Verónica Mercatante et Pablo Pathauer, pour leur précieuse collaboration. BIBLIOGRAPHIE ALLIANI, R. 1990. 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John Wiley & Sons. 505 pp. 1 Elève en 5e année, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata (UNLP), Courrier électronique : glopez@inta.gov.ar 2 La situation, la taille et la forme conique du spécimen d'Eucalyptus globulus ssp globulus observé ont empêché d'obtenir des données suffisantes pour déterminer son cycle floral. On n'en a pas moins observé que l'anthèse se produit pendant le mois de mai.
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