13. PROBLEMAS EN LA CUANTIFICACION DE MICOTOXINAS Y NIVELES DE CONTAMINACION EN MEXICO

Por:
Juan Carlos Medina B.
Eliezer Castillo
Joel Muñoz
Miguel Romero
NUTEK S.A. de C.V.
Tehuacán, Pue. 75700 México

13.1. Resumen

Considerando que los efectos de las micotoxinas, metabolitos tóxicos generados por hongos, son una preocupación constante para la industria pecuaria latinoamericana, sobre todo para los sectores avícola y porcícola, y que en nuestra zona geográfica son escasas las publicaciones con respecto a los niveles de contaminación tanto en insumos como en alimentos terminados—inclusive en la literatura especializada se reportan sólo algunos informes sobre la contaminación de micotoxinas en sorgo — se preparó el siguiente trabajo.

Por lo tanto, el objectivo de este trabajo es presentar un reporte con los resultados que se han obtenido en el laboratorio de química de esta empresa, anteriormente denominada Investigación Aplicada S.A. de C.V., este informe contiene la información sobre los niveles de aflatoxinas B₁, B₂, G₁ y G₂, zearalenona, zearalenol, citrina, fumonisina B₁, toxina T-2 y deoxinivalenol (vomitoxina), presentes en cerca de 700 muestras de alimentos terminados, sorgo, maíz, gluten de maíz, concentrados de flor de cempasúchil y pasta de soya. Todas las muestras fueron remitidas para su análisis durante el primer se mestre de 1993.

En la primera parte de este trabajo se presentan los aspectos característicos de cada etapa del proceso analítico para cuantificación de micotoxinas, haciendo referencia a los principales problemas que se deben resolver para obtener resultados correctos.

13.2. Introducción

El conocimiento de los efectos tóxicos que causan los metabolitos producidos por hongos en los seres humanos, en los animales y en las plantas está en continuo estudio y cada vez se cuenta con mayor información. Desafortunadamente, todos los cereales están sujetos a la invasión de hongos y consecuentemente a la contaminación por micotoxinas.

Las enfermedades causadas por estas micotoxinas en los seres humanos han sido reportadas desde hace siglos. En la edad media, una enfermedad denominada Fuego de San Antonio se presentó misteriosamente en algunas villas de Europa. Las personas afectadas experimentaron alucinaciones y sensaciones similares a las de las quemaduras, provocadas por las constricciones de las venas sanguíneas en las extremidades. Se presentaba también gangrena y en la mayoría de los casos se presentaba la pérdida de las extremidades (Stack, 1991). No fue sino hasta la mitad del siglo XIX en que se demostró que la presencia de los alcaloides producidos por el hongo Claviceps purpurea causan esta enfermedad.

La aleuquia tóxica alimentaria es otra enfermedad que ha causado problemas a los seres humanos. Esta enfermedad había sido reportada en Rusia desde el siglo XIX, pero es en Ucrania donde causa efectos desastrosos durante los años de 1942 a 1947. Cuando la población se vio obligada a consumir cereales que no se pudieron cosechar en el momento oportuno y permanecieron en el campo durante el invierno, por consiguiente fueron cubiertos por la nieve, y al consumir productos elaborados con estos granos las personas experimentaron diversos efectos desde ulceraciones en la boca, garganta, estómago, con subsecuentes vómitos y diarrea. Dependiendo de la cantidad de grano consumido se afectaba la médula ósea y el sistema hematopoiético. Finalmente, presentaban hemorragias y necrosis por infecciones bacterianas y posteriormente ocurría la muerte de las victimas. Estos efectos se han atribuido a la presencia de las micotoxinas, concretamente las denominadas tricotecenos producidas por el hongo Fusarium.

Otras enfermedades atribuidas a micotoxinas son la enfermedad del arroz amarillo en Japón, producida por toxinas del hongo Penicillium, este hecho se presentó al finalizar la segunda guerra mundial; la nefropatía de los balcanes, la presencia de cáncer en el esófago en la región del Trankei en Sudáfrica, en el noreste de China, en Irán y en Carolina del Sur en USA; una enfermedad endémica de osterraquitismo denominada de Kaschin-Beck en China, Rusia y Corea del Norte; y una trombocitopenia denominada onyalai en Sudáfrica (Marasas, 1988).

Sin embargo, las micotoxicosis ocurren con mayor frecuencia en explotaciones pecuarias que en la población humana. De hecho la enfermedad X de los pavos en Inglaterra en 1960 significó el descubrimiento de las aflatoxinas y fue el inicio de una de las investigaciones más extensas que se han efectuado sobre toxinas de origen natural.

Desde que se reconocieron las micotoxinas como un problema de salud pública se han estado mejorando continuamente las técnicas analíticas para realizar su cuantificación.

Inicialmente se trabajó con cromatografía de capa fina, que tiende a ser sustituida por la cromatografía de líquidos de alta resolución. La cromatografía de gases tiene muy pocas aplicaciones y recientemente los ensayos enzimáticos se han popularizado. La recientemente desarrollada cromatografía de capa fina de alta resolución sin duda tendrá muchas aplicaciones en este terreno.

Hasta la fecha en el AOAC se han evaluado 793 métodos analíticos de los cuales 692 se aplican a aflatoxinas, (B₁, B₂, G₁, G₂ y M₁) y 101 al resto de las micotoxinas, (fumonisinas B₁ y B₂, deoxinivalenol, ocratoxinas A y B, patulina, esterigmatocistina, zearalenol y zearalenona) (Horwitz, et al., 1993).

Actualmente se han identificado cerca de 800 micotoxinas (Robb, 1993), siendo las de mayor impacto en la industria pecuaria las generadas por tres clases de hongos: Aspergillus, Fusarium y Penicillium.

13.3. Problemas en el análisis de micotoxinas en granos y alimentos terminados

Determinar cualitativa y cuantitativamente micotoxinas en cualquier insumo o un alimento terminado es un verdadero reto que es difícil de realizar, es necesario contar con la instrumentación adecuada y la experiencia en el manejo del equipo, reactivos y estandares de referencia. Especificaremos los principales problemas que se observan en las diferentes etapas que comprende el análisis de micotoxinas, muestreo, elección del método analítico, preparación de estandares de referencia, extracción, purificación de extractos, detección, cuantificación y comprobación.

13.3.1 Muestreo

El primer problema, y muy serio por cierto, es obtener muestras que sean representativas, considerando que la contaminación por micotoxinas se presenta de manera totalmente aleatoria y en concentraciones del orden de ppb (ng/g). Sin embargo en México se llegan a adquirir embarques de hasta 20,000 tm amparadas exclusivamente con una sola muestra supuestamente representativa. Estos trabajos son realizados por empresas certificadoras de calidad en los Estados Unidos (Jiménez, 1993).

El muestreo en un silo o en una bodega es un problema mayúsculo que debemos enfrentar exclusivamente con sistemas de muestreo neumáticos, tales como el Probe-vac, equipado con caladores modulares que permitan llegar a cualquier sitio de la bodega, debiendo obtenerse muestras por sectores y analizarse por separado para tener idea del nivel real de contaminación, se debe recomendar trabajar con muestras del orden de 100 kg, homogenizarlas, someterlas a procesos reiterativos de cuarteo y molienda hasta obtener las muestras representativas que se remiten al laboratorio.

El problema al que generalmente debemos enfrentarnos es el muestreo en furgones o camiones. La literatura especifica que para el caso de maíz deben obtenerse muestras del orden de 10 lb en diferentes puntos de muestreo (Whitaker, 1979). Nuestra experiencia nos ha demostrado que trabajando con sorgo se deben obtener muestras de cerca de 20 kg de peso, y por lo menos 11 secciones de muestreo y con caladores de la longitud suficiente para llegar al fondo del furgón o del camión. Una vez obtenida la muestra se homogeniza y se procede a cuartear hasta obtener una muestra de aproximadamente 5 kg; se somete a molienda y cuarteo (se recomienda el molino Romer) y se obtiene una muestra de cerca de un kg, que se somete a molienda y cuarteo de modo que la muestra que se remite al laboratorio, aprox. 250 g, debe pasar a través de malla 20.

En el caso de alimentos terminados las muestras no deben ser menores a 2 kg. Un ejemplo de la variabilidad de la distribución de aflatoxinas se reporta en la Tabla 13.1. que presenta los resultados obtenidos en dos lotes de alimento, A y B, obteniendo muestras repetidas de aproximadamente de 3 libras y utilizando el sistema de muestreo Prove-Vac (Park et al., 1988).

nd = no detectado          - = no analizado

13.3.2 Elección del método

Una vez obtenida una muestra representativa se procede a realizar el análisis ya sea cuantitativo o cualitativo.

En México, el cereal más utilizado en la industria pecuaria es el sorgo, por lo tanto este grano es la base con que se elaboran los alimentos terminados y consecuente las determinaciones analíticas deben orientarse hacia la aplicación de la metodología que se encuentra disponible para estos productos.

Cuando se va utilizar un método analítico para efectuar cualquier determinación es necesario considerar alguno que haya sido evaluado por una asociación analítica de prestigio internacional como la American Association of Cereal Chemists (AACC),Americam Oil Chemists' Society (AOCS), Association Official of Analytical Chemists International (AOAC International), International Organization for Standardization (ISO), International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), Codex Committee on Methods of Analysis and Samples. El punto de vista de la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos es que, aún trabajando con un método oficial AOAC para determinación de micotoxinas, no se tiene la garantía de que los resultados obtenidos sean correctos y el analista tiene la responsabilidad de demostrar que utilizó el método adecuadamente.

Considerando que en los Estados Unidos no se le ha dado importancia al sorgo y más aún que se considera que la contaminación con micotoxinas es escasa o casi nula (CAST, 1987), bajo estas circunstancias nos enfrentamos al problema de que ninguna de las asociaciones que mencionamos ha evaluado un método para la cuantificación de micotoxinas en sorgo o en alimentos elaborados a base de este cereal, lo mismo ocurre con alimentos terminados destinados a nutrición acuicola, es por tanto necesario evaluar paso a paso cada etapa de los análisis aplicados a maíz para encontrar los métodos que se pueda adaptar al cereal que utilizamos y a los alimentos destinados a peces. Por supuesto que se deben considerar los recursos con que se cuente en cada empresa. En nuestro laboratorio se utilizan las determinaciones por cromatografía de líquidos de alta resolución y los sistemas comerciales ELISA. Se está desarrollando las técnicas de cromatografía en capa fina de alta resolución y prácticamente no se utiliza la cromatografía en capa fina.

13.3.3 Estándares de referencia

En latinoamerica no es posible adquirir patrones de referencia para ninguna micotoxina, es por lo tanto necesario proceder a realizar las importaciones ya sea de los Estados Unidos o bien de otros países, un ejemplo claro de la dificultad fue la obtención del estándar de fumonisina B₁ qúe es elaborado en Sudáfrica, aunque actualmente ya se encuentra disponible en los Estados Unidos.

El siguiente problema con un estándar de referencia es evaluar su concentración. Es verdaderamente sorprendente el hecho de comprobar que cuando se adquieren presentaciones de micotoxinas de un mg o de cualquier otro peso, tendremos que al disolverse sólo se recupera del 70 al 90% de la cantidad que aparece en la etiqueta (Bennett and Shotweell, 1990), por lo tanto quien no verique la concentración de sus soluciones patrón siempre estará reportando valores equivocados.

En este laboratorio se ha encontrado que la concentración de aflatoxina B₁ es del orden del 70% a la especificada por el fabricante de un sistema ELISA.

Otro problema que en algunos casos se presenta es el hecho de que existe inestabilidad en las soluciones de micotoxinas, por ejemplo los tricotecenos se descomponen, en menos de un mes, cuando se disuelven en metanol (Wei et al., 1986).

Afortunadamente el AOAC International ha prestado mucha atención en este aspecto y en su manual se presentan las técnicas de verificación de la concentración de micotoxinas.

Estas medidas deben realizarse periódicamente debido a que las concentraciones de micotoxinas en solución pueden variar por la evaporación de solventes o bien otros factores.

13.3.4 Extracción de micotoxinas

El proceso siguiente es lograr que la micotoxina que se encuentra combinada dentro de los cereales o bien en los alimentos terminados sea extraída, por lo tanto es vital utilizar los extractantes adecuados.

Debemos recordar que el comportamiento en solubilidad de las micotoxinas cristalizadas, químicamente puras, es muy diferente al de las propias micotoxinas presentes en cualquier contaminación natural, por lo tanto los solventes que fácilmente disolverían a las micotoxinas puras no son capaces de realizar la extracción completa en un alimento o insumo. Para realizar esta etapa del análisis es necesario utilizar mezclas acuosas con solventes polares, tales como acetonitrilo, acetona, cloroformo o metanol.

Otro aspecto a considerar es el tiempo y la técnica de extracción; sirva de ilustración de este hecho un trabajo de Romer, 1990 en que evaluó la composición de los extractantes en diferentes sistemas de extracción y con diferentes tiempos, aplicándolos a la cuantificación de aflatoxinas. Los resultados se presentan en las Tablas 13.2. y 13.3.

Debemos señalar que el extractante a base de cloroformo-agua es el recomendado por la FDA, mientras el departamento de agricultura de los Estados Unidos, USDA, recomienda el empleo del extractante metanol-agua.

13.3.5 Purificación y limpieza de los extractos

Junto con las micotoxinas es de suponer que en el extracto se cuenta con muchas substancias que por su propia naturaleza pueden interferir en la detección de micotoxinas, por lo tanto es necesario proceder a eliminarlas antes de continuar con la siguiente etapa del trabajo; en los primeros métodos oficiales AOAC, se consideran los procesos de precipitación de interferencias, desengrasado, partición entre solventes y purificación a través de columnas de cromatografía en columna abierta. Indudablemente que cada etapa de este proceso significaba una posibilidad de pérdida de la micotoxina que se estaba investigando, además de ser un procedimiento demasiado caro, por el tiempo y la cantidad de reactivos consumidos e imposible de hacerse en forma automatizada, aunque todavía en 1993 en la literatura se encuentran reportes con esta serie de inconvenientes, afortunadamente esta etapa ha experimentado un proceso de cambio, muy importante con el advenimiento de los sistemas de purificación en fase sólida, que tienen la enorme ventaja de simplificar el trabajo y utilizar el mínimo de reactivos. Entre estas columnas se deben mencionar las de inmunoafinidad, con anticuerpos específicos para una micotoxina en particular, como las columnas Fumonitests fabricadas por Vicam. Las que utilizan fase reversa, sílice recubierta con radicales de 18 u 8 átomos de Carbono, tales como los Sep-pack, elaborados por Millipore. O bien las columnas multifuncionales, de composición patentada del tipo de las columnas Myco-sep 224, fabricadas por Laboratorios Romer.

La diferencia entre las eficiencias de cada columna se especificaran cuando se mencionen las dificultades en la etapa de cuantificación.

13.3.6 Detección

Los métodos analíticos se dividen en dos categorías, cualitativos y cuantitativos, dependiendo del alcance que se quiera obtener, si se trata de ensayos cualitativos la detección es su etapa final. En este renglón debemos mencionar que el método cualitativo desarrollado para micotoxinas más fácil de realizar fue el uso de lámpara de luz negra, sin embargo debemos menciona que nunca fue considerado como un método oficial AOAC y se diseño exclusivamente para la determinación cualitativa de aflatoxinas en maíz. Posteriormente el AOAC consideró como adecuados el uso de las minicolumnas de Holaday-Velazco y de Romer, teniendo como finalidad la detección de aflatoxinas por estimación visual. El extracto con esta micotoxina pasaba a través de la columna, conformada con diferentes empaques que retenían impurezas, de modo tal que las aflatoxinas quedaban retenidas en la sección empacada con florisil que cuando se sometían al efecto de la luz ultravioleta de longitud de onda larga se apreciaba fluorescencia; entonces se reportaban como positivas, sino no se observaba esta señal se consideraban negativas.

Desde 1970 hasta 1985 estos dos métodos fueron los únicos ensayos disponibles, hasta que aparecieron los métodos inmunológicos, ELISA, que originalmente se diseñaron para la cuantificación de aflatoxina B₁ y posteriormente se lanzaron al mercado para otras micotoxinas tales como zearalenona, ocratoxina, fumonosina, toxina T-2, vomitoxina, etc. Estos métodos son rápidos, relativamente fáciles de llevar a cabo y el precio es moderado.

Los sistemas ELISA tiene como principio el contener un anticuerpo de una micotoxina en particular inmovilizado en una superficie sólida, tal como un minivaso, una tarjeta o bien otro soporte, estos anticuerpos contienen sitios de enlace con los cuales las micotoxinas reaccionan, pero también los conjugados enzimáticos de estas micotoxinas, que se adicionan exprofeso, de modo tal que se establece una competencia por los sitios de unión, después de un determinado tiempo de reacción se eliminan todas las substancias que no hayan reaccionado y se procede a adicionar un substrato, que después de un tiempo de reacción da lugar a una reacción de desarrollo de color, generalmente con peróxido de hidrógeno, después de un determinado tiempo se procede a establecer una comparación visual entre la coloración de la solución del estándar de referencia y las muestras, un color más rojizo indica una concentración mayor que el estándar y una coloración azul indica una concentración menor que el estándar, también se puede efectuar estas lecturas de las soluciones de manera espectrofotométrica. La Tabla 13.4. muestra la relación de anticuerpos de micotoxinas que se encuentran disponibles comercialmente.

El AOAC ha evaluado y aceptado los sistema ELISA denominados Agri-screen, Aflatest, Aflacup y Biocode. Debido a la importancia que ha adquirido y a los continuos cambios que estos sistemas han experimentado el AOAC ha creado una sección especial de evaluación para comprobar los niveles de sensibilidad y especificidad.

M = anticuerpo monoclonal          P = anticuerpo policlonal

En un estudio realizado por el servicio federal de inspección de granos del departamento de agricultura de los Estados Unidos se hace la comparación de resultados para muestras de maíz entre la columna Holaday-Velazco y 3 sistemas comerciales ELISA, una columna de inmunoafinidad y una columna empacada (SAM, actualmente denominada Target).

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 13.5.

E = equivalente;   M = mejor;   R = rechazado.

Otro aspecto a considerar con los ensayos cualitativos es la posibilidad de reportar resultados falsos, ya sea falsos negativos o falsos positivos. Al respecto se presentan, en la Tabla 13.6., los resultados del análisis semicuantitativos de aflatoxinas obtenidos por Park et al., 1988, quienes realizaron un ensayo de evaluación de dos sistemas ELISA, una columna de inmunoafinidad y el sistema de cromatografía en capa fina. Este trabajo se realizó con muestras de harinolina y de alimentos terminados. El nivel de detección que se consideró fue de 20 ppb.

Un problema que se presenta al analizar micotoxinas, por cromatografía en capa fina, en alimentos que contienen como ingredientes pigmentos de origen natural es el hecho de que presentan fluorescencia que interfieren en las determinaciones dando lugar a que se reporten falsos positivos (Javierre, 1993).

Un caso similar se presenta cuando en las muestras existen antioxidantes, principalmente el etoxiquim, que suele confundirse como aflatoxina B₁, ya sea en harina de pescado o en concentrados de flor de cempasúchil.

En 1990 Medina y Romero reportaron en el congreso internacional del AOAC un estudio comparativo para la detección de aflatoxina B₁, en muestras de sorgo, entre un sistema comercial ELISA, Agri-Screen, contra la técnica de cromatografía de líquidos de alta resolución, los resultados se presentan en la Tabla 13.7.

13.3.7 Cuantificación

Dos son los parámetros básicos que deben contemplarse cuando se realiza un ensayo cuantitativo, la exactitud y la precisión del método, en caso de las micotoxinas estos aspectos son de gran importancia. La exactitud comprende la cantidad recuperada de la micotoxina que se está analizando desde la extracción hasta la cuantificación y generalmente se verifica realizando ensayos con una cantidad determinada de la micotoxina a cuantificar ya sea realizando el proceso en una muestra conteniendo una cantidad certificada, o bien mediante la adición al extracto de una cantidad conocida del patrón de referencia. Como un ejemplo de la exactitud de los métodos analíticos tenemos los ensayos de recuperación que se muestran en Tabla 13.8. Se trabajó utilizando una columna multifuncional y cromatografia de líquidos de alta resolución, este procedimiento se utilizó tanto en sorgo como en alimentos terminados los ensayos de recuperación se realizaron con soluciones de estandares de referencia de aflatoxinas y zearalenona (Medina et al., 1991).

Otro ejemplo de la sorprendente exactitud de esta técnica son los resultados reportados por W. Hagler, 1991, quien trabajando con muestras de 6,000 muestras de maíz y de alimentos terminados reportó una exactitud del 100% para la determinación de aflatoxinas. Este trabajo también se desarrollo por cromatografía de líquidos de alta resolución y una columna multifuncional de limpieza.

La precisión se refiere a la variabilidad de un método analítico, esto es qué resultados se deben esperar cuando se analiza una misma muestra en diferentes ocasiones, ya sea en el mismo laboratorio o en laboratorios diferentes. Para tener idea de como han cambiado la precisión de los métodos analíticos mencionaremos los resultados obtenidos por Pons, quien en 1980, realizó un estudio de comparación de 3 técnicas cromatográficas, los resultados se presentan en la Tabla 13.9.

La falta de precisión que se observa en este ensayo se debe indudablemente a la cantidad de trabajo que implican los procesos de purificación que se utilizaron, tales como precipitación de interferencias, partición, desengrasado y purificación a través de una columna abierta. Aunque la técnica de lectura que se utilizó para la cromatografia en capa fina fue instrumental, no se puede comparar la variación que se obtuvo contra la cromatografía de líquidos en los ensayos interlaboratorios.

En 1991, Hagler y colaboradores reportaron en el congreso del AOAC que la precisión de la técnica por cromatografía de líquidos para la cuantificación de aflatoxinas, en alimentos terminados y maíz, utilizando un sistema de detección por fluorescencia, efectuando prederivatización con ácido trifluroacético es del ± 2%.

Esta misma técnica fue evaluada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y se le concedió un valor de 176 sobre una escala de 200 puntos. El único problema es la inversión inicial para adquirir un sistema HPLC (Koeltzow, 1991).

En ese mismo estudio se hizo una evaluación de una columna de inmunoafinidad, el primer sistema comercial de este tipo, y esta técnica alcanzó un valor de 196 sobre los 200 puntos posibles.

Sin embargo en 1993, se publicó una evaluación de esta misma columna de inmunoafinidad y de un sistema ELISA considerado como cuantitativo, para la determinación de aflatoxinas. Participaron 37 laboratorios de todo el mundo, entrenados para trabajar con estos métodos, y los resultados demostraron que aún falta mucho para decir que ya se cuenta con métodos fáciles y económicos. Los resultados obtenidos con los métodos inmunológicos se compararon con los obtenidos por cromatografía de líquidos, la información se resume en la Tabla 13.10.

Como se aprecia es increíble la variación que se reporta utilizando estas dos técnicas, aquí cabe hacer la aclaración que en la utilización de inmunoensayos es muy importante que el analista comprenda realmente que es lo que ocurre en cada etapa del análisis.

Los resultados relativamente bajos que se aprecian en concentraciones del orden de 200 ppb se deben indudablemente al procedimiento de extracción realizado de manera incompleta, por falta de tiempo de extracción probablemente y los resultados fuera de orden, extraordinariamente altos, en el caso de muestras libres de aflatoxinas se deben a contaminaciones por compuestos fluorescentes, presentes tanto en los reactivos como en material empleado para efectuar las determinaciones analíticas.

En 1991 el servicio de agricultura de los Estados Unidos evaluó un sistema ELISA para la determinación de aflatoxinas y por los resultados que se reportaron indudablemente que este sistema debía de tener problemas de caducidad, o bien que se manipuló de manera incorrecta (Koeltzow, 1991). Los resultados se reportan en la Tabla 13.11. En nuestra experiencia, cuando ocurre una mala manipulación, principalmente por presencia de contaminación en las mesas de trabajo, se puede reportar como positivos hasta la solución extractante que se utiliza como testigo.

13.3.8 Confirmación

Tener la seguridad que en realidad se está detectando la micotoxina a investigar representa una de las etapas más importantes del procedimiento analítico. Por que no tendría sentido contar con métodos con una variabilidad de ± 2% o con una recuperación cercana al 100%, sino se tiene la seguridad de que se está detectando el compuesto de interés y no otro. En la cromatografía en capa fina se puede dar el caso de una substancia que fluoresca de color azul, a la luz ultravioleta de longitud de onda larga, que quede a la misma altura dentro de una placa cromatográfica y presente el mismo rf que la afla toxina B₁; esto no sería suficiente para decir que se trata evidentemente de esta micotoxina.

En México es común que se reporte la presencia de esta aflatoxina en harina de pescado o en concentrados de flor de cempasúchil, cuando en realidad lo que se está detectando es el antioxidante, etoxiquin, utilizado para estabilizar estos productos.

Por cromatografía de líquidos es posible que se confunda con la aflatoxina B₁ un compuesto fluorescente presente en la yuca que tiene prácticamente el mismo tiempo de retención.

De no realizar los ensayos de confirmación es posible que se reporten resultados equivocados, generalmente los ensayos de confirmación se llevan a cabo por reacciones químicas.

La técnica de confirmación que está muy lejos de cualquier laboratorio comercial y que exclusivamente se utiliza en laboratorios de investigación es la espectrofotometría de masas.

Entre los procedimientos de confirmación utilizados frecuentemente son las reacciones de derivatización, algunas con el propósito de incrementar la fluorescencia de la micotoxina a cuantificar, como el caso de las aflatoxinas G₁ y B₁ que al reaccionar con ácido trifluoroacético producen las aflatoxinas G_2a y B_2a respectivamente. O bien con el propósito de hacer desaparecer la fluorescencia como en el caso de la ocratoxina A que se trasforma a su ester metílico.

Otros procedimientos que se aplican son aquellos utilizados para cambiar el color de la fluorescencia obtenida, tal como ocurre en la detección de la aflatoxina B₁ por cromatografía en capa fina, que de color azul se transforma por efecto del ácido sulfúrico a un compuesto de fluorescencia amarilla-café.

Otra técnica de confirmación consiste en cuantificar determinada micotoxina a diferentes longitudes de onda y observar que mantienen la misma relación que el patrón de referencia.

Entre las técnicas de confirmación que se utilizan en cromatografía destaca la adición de una solución de referencia al extracto purificado que contiene la micotoxina a investigar, antes de inyectar al sistema, y observar como se incrementa la señal que corresponde a dicha micotoxina.

13.4. CONTAMINACIÓN CON MICOTOXINAS EN INSUMOS Y ALIMENTOS TERMINADOS EN MÉXICO

El sorgo es sin duda alguna el principal grano empleado en la elaboración de alimentos balanceados en México, en contraste con un consumo estrictamente regional en los Estados Unidos, por lo que no debe causar extrañeza que se preste muy poca atención en cuanto a la contaminación con micotoxinas.

La poca importancia que se le confiere da lugar a que se afirme que es muy poco susceptible a que se desarrollen éstos metabolitos, como un ejemplo citaremos el libro Micotoxinas publicado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos en el CAST Report 116, 1989.

El descubrimiento oficial de las aflatoxinas en sorgo solo ocurrió hasta 1976 cuando Stoloff reportó su presencia. Por supuesto que en México se cuantificó previamente: se tiene la seguridad de que en ANDSA, Almacenes Nacionales de Depósito, debido a que contaban con un laboratorio para análisis de estas toxinas, ya se habían determinado. También en Tehuacán en Investigación Aplicada S.A. se realizaban de manera rutinaria estos ensayos. Uno de los primeros testimonios publica dos al respecto corresponde a una tesis profesional presentada en la Escuela de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Puebla sobre la determinación de aflatoxinas y aislamiento de Asper gillus flavus (Cepeda, 1970).

En 1969, Shotwell y colaboradores del Dpto. de Agricultura de los Estados Unidos reportaron que al analizar 533 muestras de sorgo cultivado en los Estados Unidos no se encontró la presencia de aflatoxinas.

La primera vez que el Departamento de Agricultura de USA reportó la presencia de aflatoxinas en sorgo solo fue hasta 1980 cuando Shotwell y colaboradores informaron que, en un muestreo realizado entre 1975–1976 en 10 estados de la Unión Americana, 4 muestras manifestaron la contaminación, en total se analizaron 197 muestras.

McMillan y colaboradores reportaron en 1983 que en un muestreo realizado en el Estado de Georgia entre 1980 y 1981 la contaminación por aflatoxinas se presentó en el 56% de las muestras, alcanzando niveles de hasta 99 ppb. Sin embargo las muestras obtenidas en el Estado de Mississippi se reportaron exentas de esta misma toxina.

En cuanto a los niveles de contaminación en México se ha reportado que en 1990 el 36% de las muestras analizadas se detectaron a niveles superiores a 20 ppb, mientras que el 7.3% de las muestras tuvieron concentraciones superiores a 100 ppb (Medina et al., 1991).

Si los informes sobre contaminación de aflatoxinas en sorgo son escasos, la información sobre la presencia de otras micotoxinas es menor.

Las ocratoxinas son metabolitos producidos por ciertas especies de los géneros Aspergillus y Penicillium. La ocratoxina A es el metabolito de mayor significación toxicológica y es principalmente un contaminante de los cereales tales como maíz, trigo, centeno y avena. También se ha encontrado en otros productos vegetales como la soya, el café y cacao, además de cacahuates e inclusive en hígados de cerdo (Krogh, 1987).

De acuerdo con el Dpto. de Agricultura de los Estados Unidos, USDA, y la FDA la contaminación con ocratoxina A en sorgo nunca ha sido detectada, el límite de detección del método que han empleado es de 10 ppb (Wood, 1992). Sin embargo Harvey y colaboradores reportaron la presencia de ocratoxina A en un alimento destinado a cerdos, la característica principal de este problema fue que el alimento fue rechazado por los animales (Harvey et al., 1987).

En México Medina y colaboradores reportaron en 1992 que la contaminación en sorgo por ocratoxina A fue de 25.5%, considerando un límite de detección de 1 ppb. El valor promedio de las muestras positivas fue de 15.3 ppb y el valor máximo encontrado fue de 82 ppb.

La zearalenona es una micotoxina estrogénica producida por diferentes especies de Fusarium. Su presencia se ha asociado con problemas reproductivos en algunas especies animales y probablemente en los seres humanos. Se considera como un contaminante del maíz aunque también se desarrolla en diversos cereales, se ha reportado en avena, cebada, trigo, soya y sorgo, por supuesto que la mayoría de los informes que se encuentran en la literatura se refieren a maíz. El primer informe sobre la presencia de zearalenona en sorgo corresponde a Schroeder y Hein en 1975. Shotwell y colabora dores, en 1980, reportaron que de 197 muestras analizadas 56 estaban contaminadas con esta micotoxina, detectándose valores desde 200 hasta 6,900 ppb.

En 1983, McMillan y colaboradores reportaron la incidencia de zearalenona en el 31% de las muestras de sorgo procedentes de Georgia, el nivel máximo detectado fue de 1,468 ppb y las muestras del Estado de Mississippi se reportaron libres de esta contaminación.

En México la contaminación durante 1990 fue de un 16% en niveles superiores a 100 ppb y de 3% en niveles superiores a 1,000 ppb (Medina et al., 1991). En 1991 se reportaron niveles de contaminación superiores a 100 ppb en el 17.0% de las muestras, 2.4% con niveles entre 250 a 1,000 ppb y 0.9% de las muestras con niveles mayores de 1,000 ppb. En total se analizaron 124 muestras (Medina et al., 1992).

La vomitoxina, deoxinivalenol o DON fue reportado por primera vez en sorgo por W. Hagler, en 1987. En México, la contaminación con esta micotoxina en 48 muestras analizadas durante 1991 fue la siguiente: se encontrarón niveles de contaminación superiores a 500 ppb en el 66.6% de las muestras analizadas y niveles superiores a 1,000 ppb en el 12.5% de ellas.

La contaminación con toxina T-2 nunca ha sido reportada como causa de un problema de toxicosis natural en la industria avícola y porcina de los Estados Unidos. Sin embargo en México es común que en el campo se observen las lesiones que produce esta toxina, pero la toxina T-2 pertenece a un grupo de fusariotoxinas denominado tricotecenos, hasta la fecha existen reportadas más de 148 de estas micotoxinas, y un grupo de ellas los escirpenoles producen las mismas lesiones. La contaminación en México reportada en 1992 fue menor a 500 ppb en 18 muestras analizadas (Medina et al., 1992).

Con respecto a la citrinina La FDA reportó en 1992 que nunca se había detectado la presencia de esta micotoxina en los Estados Unidos (Wood, 1992).

Las fumonisinas son micotoxinas de reciente aislamiento. Son producidas por el hongo Fusarium moniliniforme y se han informado como inductores de cáncer en ratas (Gelderblom et al., 1988). Estas toxinas ocurren naturalmente en maíz y se han asociado también a problemas de leucoencefalomalacia equina y al síndrome del edema pulmonar porcino en los Estados Unidos (Ross et al., 1990). En México, se ha informado que la contaminación en sorgo para esta micotoxina durante 1992 fue del 18.2%, con 1,750 ppb como promedio; los niveles de contaminación oscilaron entre 650 a 2,930 ppb (Medina et al., 1993).

Durante este primer semestre de 1993 se han detectado variaciones en los niveles de contaminación con diversas micotoxinas, por ejemplo ha disminuido la cantidad de aflatoxinas en sorgo. En este trabajo se describe por primera vez, en nuestro laboratorio la contaminación en maíz, también se publican resultados obtenidos en muestras de pasta de soya, gluten de maíz y concentrados de cempasúchil, por supuesto que se presentan los niveles de contaminación en muestras de sorgo y de alimentos terminados. Se cuantificaron aflatoxinas B₁, B₂, G₁, G₂, fumonisina B₁, ocratoxina A, deoxinivalenol (vomitoxina, DON), zearalenona, zearalenol, toxina T-2, citrinina. Se utilizó la técnica de cromatografía de líquidos para la determinación de aflatoxinas, ocratoxina, fumonisina, citrina, zearalenol y zearalenona. Se utilizaron ensayos ELISA para la determinación de deoxinivalenol y toxina T-2. En total se informan aproximadamente 700 valores obtenidos en el período en que se especificó. Las muestras de maíz, gluten de maíz y sorgo en su mayoría corresponden a importanciones, en los otros casos los insumos son de origen nacional. El reporte corresponde a muestras recibidas de todo el país, en el caso de maíz se incluyeron muestras remitidas desde Chile. La contaminación de aflatoxinas en concentrados de flor de cempasúchil fue menor a 20 ppb en 7 muestras analizadas. El resto de los resultados analíticos se resumen en las Tablas 13.12. a 17.

El maíz es el grano más susceptible de contaminación a aflatoxinas, sobre todo el que se produce en la región sureste de los Estados Unidos. Sin embargo otras zonas de dicho país no están exentas de contaminación. La Tabla 13.14. es un ejemplo de la variación en los niveles de aflatoxinas por zonas geográficas y por años, se presentan los resultados reportados por la FDA para maíz destinado a nutrición animal (Wood, 1992).

En este informe se consideran los resultados obtenidos en los años fiscales 1989, 1990 y 1991 para cuatro zonas geográficas. Las muestras correspondientes al resto de los estados de la Unión Americana no se detectaron como positivas a esta contaminación.

(1) AL, FL, GA, KY, LA, MS, NC, SC, TN
(2) IA, IL, IN, KS, MI, MN, MO, NE, OH, SD, WI

13.5. Evaluación de aluminosilicatos in vitro

Considerando que el uso de aluminosilicatos representa una alternativa para evitar los efectos de las aflatoxinas y que en el mercado nacional se comercializan diferentes productos y que también existe desorientación al respecto, se realizó la evaluación de la capacidad de adsorción de diferentes productos comerciales, nacionales y extranjeros. Se utilizó exclusivamente aflatoxina B₁. El trabajo consistió en realizar una etapa de adsorción a 37°C, por 3 horas, en solución ácida de pepsina, en condiciones idénticas a las especificadas para la determinación de digestibilidad según el método AOAC. La fracción no adsorbida se cuantificó por cromatografía de líquidos. Posteriormente se eliminó la solución que contenía las aflatoxinas y se procedió a efectuar una etapa de desorción con la misma solución, y se cuantificó la cantidad de aflatoxina B₁ que se logró extraer. Por último se repitió el procedimiento de desorción utilizando una mezcla de acetonitrilo-agua (9+1), que es el solvente específico para la extracción de aflatoxinas. Los resultados se resumen en la Tabla 13.18.

13.6. Conclusión

El análisis de micotoxinas es una labor difícil, porque la contaminación con estas toxinas en las muestras, tanto de granos como de alimentos terminados, se encuentran a niveles considerados como trazas. Sin embargo es innegable el rápido desarrollo de la metodología, sobre todo desde hace unos 10 años. Se han simplificado y mejorado los métodos analíticos existentes, ahora se cuenta con una instrumentación sensible y versátil, las columnas de limpieza también han revolucionado el trabajo analítico.

En cuanto a los niveles de micotoxinas presentes en los insumos y alimentos balanceados se observa que la concentración de estas toxinas tiende a ser mayor en los alimentos que en las materias primas, la razón de este hecho se puede atribuir a las condiciones de almacenamiento que experimentan estos nutrientes.

La contaminación con micotoxinas en sorgo y alimentos destinados a nutrición acuicola no han sido considerados de parte de las agencias oficiales de los Estados Unidos por lo que no existen métodos analíticos que se apliquen especificamente a este grano, es necesario realizar adaptaciones y evaluar rigurosamente el proceso analítico.

En el primer semestre de 1993 la contaminación de micotoxinas fue superior en las muestras de maíz que en las muestras de sorgo analizados en nuestro laboratorio.

13.7. Bibliografía

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