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CAPITULO 14

METODOS ANALITICOS PARA LA DETERMINACION DE HUMEDAD, ALCOHOL, ENERGIA, MATERIA GRASA Y COLESTEROL EN ALIMENTOS


Lilia Masson

HUMEDAD

La determinación de humedad es un paso obligado en el análisis de alimentos (1,2). Es la base de referencia que permite: comparar valores; convertir a valores de humedad tipo; expresar en base seca y expresar en base tal como se recibió.

Por estas razones debe seleccionarse cuidadosamente el método a aplicar para la determinación de humedad en un alimento, ya que un mismo método no sirve para todos los alimentos.

En general, los más usados aplican un cierto grado de calor. El alimento sufre cambios que pueden afectar el valor obtenido como humedad. Se pierden compuestos volátiles junto con el agua, como alcohol, aceites esenciales y materia grasa.

En el Cuadro N° 1 se encuentra un resumen de los métodos más usados para la determinación de humedad en alimentos, señalando brevemente sus ventajas, limitaciones y aplicaciones.

ENERGIA

Los métodos más usados (3) son:

1. Bomba calorimétrica

Requiere correcciones por el calor producido por solubilización de los óxidos de azufre y nitrógeno.

La calibración se realiza generalmente con ácido benzoico como patrón termoquímico.

Los valores obtenidos son los valores brutos de combustión y que deben diferenciarse de los valores de energía metabolizable, que habitualmente se emplean en nutrición.

2. Cálculo por factores

La energía metabolizable se calcula aplicando los factores para: proteína, materia grasa, cabohidratos disponibles, ácidos orgánicos y alcohol.

En particular para fibra dietética, alcoholes azúcares, oligosacáridos, no hay aún acuerdo para estos componentes.

La expresión kilocalorías se sigue usando, a pesar que se recomienda el sistema internacional de kilojoule. El factor de conversión es 1 kcal = 4,184 kJ

Al expresar el valor de energía de un alimento deberá evitarse de usar más de tres cifras significativas. El método empleado cualquiera que sea debe ser descrito claramente.

Las siguientes consideraciones se deben tener en cuenta:

Cuadro 1
Métodos mas usados para la determinación de humedad

Temperatura °C Tiempo Limitaciones Ventajas Aplicaciones
METODO
DESECACION POR ESTUFA
       
130 ±1°
105 ± 1°
3 hrs.
Peso constante
±5mg
Destructivo, pérdida de volátiles.caramelización de azúcares, no aplicable a alimentos azucarados, grasas o aceites esenciales. Rápido Semillas oleaginosas
Mayoría de los alimentos
60° a presión reducida   Lento, pérdida de volátiles Método Universal Alimentos azucarados, materias grasas.
Alimentos con aceites esenciales.
Variante de agregar arena tanto a 105° C como a 60°C y a presión reducida *     Facilita la determinación. Mayor superficie para la salida de la humedad general. Alimentos con contenido graso importante. Alimentos en general.
HORNO MICROONDA   Costo del equipo Rápido Alimentos, humedad alta y media
KARL FISHER   Costo del equipo Rápido Alimentos de muy baja humedad.
Alimentos higroscópicos.
NMR   Costo del equipo, necesita calibración Rápido Mayoría de los alimentos, semillas.
LIOFILIZACION   Permanece agua residual, costo del equipo No altera el producto Mayoría de los alimentos
DETERMINACION CON ARRASTRE CONXILOLO TOLUENO (MET. DEAN Y STARK)     Rápido. Determina sólo la humedad. Alimentos con alto contenido de materias volátiles, pimentón, cebolla, margarina, mantequilla, manteca.
* La adición de arena normalmente facilita el procedimiento de secado de la muestra, sobre todo si esta contiene un porcentaje elevado de materia grasa, o azúcares
  1. La energía bruta de diferentes proteínas, materia grasa y carbohidratos es constante para todos los alimentos.
  2. Las medidas de digestibilidad aparente dan una indicación exacta de la energía disponible.
  3. Los coeficientes de digestibilidad aparente son constante para todos los alimentos.
  4. La digestibilidad no varía significativamente entre los individuos.

Energía bruta

Es la energía liberada como calor cuando el alimento se quema en la bomba calorimétrica. Se puede obtener por cálculo en base a la composición química del alimento utilizando los siguientes factores de conversión:

- Proteína: 5,4 kcal o 23 kJ/g
- Carbohidrato: 4,1 kcal o 17 kJ/g
- Grasa: 9,3 kcal o 39 kJ/g

Energía disponible

Es la energía de los carbohidratos, grasas y proteínas menos la cantidad presente en las heces. A efectos de cálculo se utilizan los siguientes factores:

- Proteínas: 5,4 -1,25 = 4,15. Se aproxima a 4,0 kcal o 17 kJ/g
- Carbohidrato: 4,0 kcal o 17 kJ/g
- Grasa: 9,0 kcal o 38 kJ/g

Cuadro 2
Valores de energía para algunos componentes de los alimentos

Componente

kcal/g

kJ/g

Proteína

4

17

Materia grasa

9

37

Monosacárido

3,75

16

Disacárido

3,94

16

Almidón y glicógeno

4,13

17

Alcohol etílico

7

29

Glicerol

4,31

18

Acido acético

3,49

15

Acido cítrico

2,47

10

Acido láctico

3,62

15

Acido málico

2,39

10

Acido quínico

2,39

10

Problema de los carbohidratos

Otras tablas miden los carbohidratos disponibles, no calculan por diferencia. Calculados como monosacáridos usan 3,75 kcal o 16 kJ/g.

Fibra dietética

Se reduce la energía aparente disponible de grasa y proteína en 2-3% con ingestas moderadas y en un 4-6 % con ingestas altas

ALCOHOL ETILICO

Se pueden aplicar varios métodos (1). A continuación se reseñará brevemente la base de ellos.

1. Hidrometría

El contenido de etanol se puede medir en el destilado a partir de un volumen de la muestra exactamente medido.

Los azúcares reductores no son destilables. Interfieren el SO2 y el ácido acético a los niveles que se señalan a continuación:

Niveles de SO2 superiores a 200 mg/1
Acidez volátil que exceda 0,10%

Por esta razón las muestras deben neutralizarse antes de la destilación. La determinación se efectúa por medio de un hidrómetro calibrado y se registra la temperatura. El porcentaje de etanol en volumen se obtiene de tablas específicas.

También se puede determinar el porcentaje de etanol en volumen con hidrómetros que miden el peso específico y consultar posteriormente las tablas pertinentes.

Los hidrómetros para etanol deben calibrarse con soluciones de etanol exactamente preparadas. Este método requiere bastante experiencia y cuidados extremos en todo el proceso de neutralización, destilación, medición y control de temperatura.

2. Método densitométrico

Requiere de un equipo especial. Mide el peso específico de la muestra, por el cambio de frecuencia de oscilación en un tubo en U comparado con dos estándares.

El peso específico se convierte a porcentaje de etanol a 15,56°C. Se aplica a destilados entre 25-79° alcohólicos.

El control de la temperatura y presión son factores importantes a considerar en la determinación.

3. Método refractométrico

Ocupa el refractómetro de inmersión. Debe tenerse un muy buen control de la temperatura a 15,56°C. A temperaturas diferentes se aplican factores de corrección.

4. Determinación del etanol en peso

Se utiliza el método del picnómetro. Se debe tener la precaución de un buen control de peso del picnómetro y bien calibrado, y un muy buen control de temperatura

5. Determinación de etanol por el método de dicromato de potasio

El etanol obtenido por destilación se oxida cuantitativamente a ácido acético por un exceso de dicromato de potasio estandarizado.

Producción y manejo de datos de composicion química de alimentos en nutrición

El exceso de K2Cr207 se determina con solución de sulfato ferroso y amonio estandarizado. Los tiempos y temperatura de incubación para oxidar el etanol a ácido acético son críticos.

Debe tenerse especial precaución con el material de vidrio, exactitud de las mediciones, calibración de pipetas, etc. Debe realizarse un blanco.

6. Análisis de etanol por cromatografía gas-líquido (GLC)

El etanol presente en vinos, cervezas, jugos se puede separar de otros componentes por GLC. Para mejorar los aspectos cuantitativos se usa 2-propanol como estándar interno.

La relación de área de ambos picos se compara con la de una solución patrón de etanol y 2-propanol.

Se pueden emplear columnas empacadas de acero inoxidable o vidrio de 2 m rellenas con Porapack QS, Carbowax 0,2 % 1500 sobre Carbopack C 80 -100 mesh, Chromosorb 103.

Se recomienda determinar el porcentaje de etanol en volumen por un método oficial para efectos de control.

7. Método enzimático

El etanol se puede oxidar a acetaldehido por el NAD en presencia de la enzima alcohol dehidrogenasa (ADH) para producir NADH. Es una reacción esteoquiométrica en condiciones experimentales adecuadas. El NADH producido se determina espectrofotométricamente a 334, 340 o 360 nm.

Producción y manejo de datos de composicion química de alimentos en nutrición

Actualmente se dispone de mezclas preparadas. Debe tenerse precaución en la medición cuantitativa de volúmenes muy pequeños de reactivo y muestra.

La reacción se desplaza a la derecha en medio alcalino, atrapando el acetaldehido formado y luego oxidándolo a ácido acético en presencia de aldehido dehidrogenasa.

Producción y manejo de datos de composicion química de alimentos en nutrición

Dependiendo de la longitud de onda que se elija, se debe tener la precaución de que la concentración de etanol sea de 0,01 a 0,12g/l (365 nm) o de 0,005 a 0,06g/l(340o334nm).

En general en alimentos líquidos se recomienda clarificar y filtrar.

El método es muy sensible, debe tenerse especial cuidado con el agua empleada que debe estar libre de etanol. Igualmente se recomienda tapar las cubetas en el momento de la lectura. El etanol es muy volátil. Debe trabajarse en atmósfera libre de etanol. Para controlar el método se recomienda emplear una solución patrón de etanol.

LIPIDOS

Desde el punto de vista de una base de datos de composición de alimentos, el análisis y determinación de los diferentes componentes lipídicos de un alimento encierra una serie de desafíos y problemas.

Entre las determinaciones más frecuentes se pueden señalar:

- materia grasa total
- materia insaponificable
- esteroles
- ácidos grasos
- pigmentos carotenoides
-

vitaminas liposolubles A, D, E, K

Para cada uno de estos temas se dispone de diversas metodologías que se expondrán brevemente a continuación. Los dos últimos serán tratados en otra sección.

1. Materia grasa total

En el Cuadro 3 aparece un resumen de los métodos más empleados en la extracción de materia grasa total. Se ha señalado brevemente sus limitaciones, ventajas y aplicaciones.

2. Materia insaponificable

Es un dato que normalmente se determina cuando se van a cuantificar esteroles u otros componentes que se encuentran en la materia insaponificable.

Métodos

- saponificación
- avado
- extracción con éter de petróleo, éter etílico
- evaporación del solvente
- pesada del residuo

Limitaciones o inconvenientes

Debe asegurarse una completa saponificación, para lo cual la preparación del KOH alcohólico es importante.

Debe realizarse una cuidadosa extracción con los solventes.

Evitar los problemas de separación de fases, formación de emulsiones.

Realizar un lavado exhaustivo para retirar jabones.

Proceder a una cuidadosa evaporación del solvente y control del residuo final por pesada, que corresponde a la materia insaponificable.

3. Esteroles por GLC

a) Métodode la Comunidad Europea (6)

El método se basa en:

Saponificación de la materia grasa con KOH alcohólico, a la cual se adiciona alfa colestanol como patrón interno.

Extracción de la materia insaponificable con éter etílico.

Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído mediante cromatografía en placa de sílica gel básica.

Los esteroles recuperados se derivatizan a trimetilsililéteres (TMSE) con mezcla piridina: hexametildisilazano: trimetilclorosilano 9:3:1, a razón de 50 TI por mg de esteroles.

Análisis por columna capilar GLC de sílica fundida o vidrio 20-30 m de largo de 0,25 a 0,32 mm diámetro interno, recubierta con fase líquida Se52, Se54 o equivalente, grosor de película entre 0,1 y 0,3 Tm y temperatura de la columna 260°C ± 5o.

Para la identificación de los diferentes picos se usan los tiempos de retención y la comparación con mezclas de TMSE de los esteroles analizados en las mismas condiciones.

El tiempo de retención del beta sitosterol se ajusta a 20±5 minutos.

Para la determinación cuantitativa se calculan las áreas de los picos del colestanol y de los esteroles dadas por el integrador y se aplica la fórmula para expresar en mg/kg de materia grasa.

b) Método general

La obtención de la materia insaponificable se puede realizar por método oficial AOAC, AOCS, Comunidad Europea (1,6).

Cuadro 3
Métodos para determinar materia grasa total

Método Limitaciones Ventajas y aplicaciones

Extracción con un solvente

Continuo (BUTT) Solventes inflamables Debe trabajarse sobre muestra seca o de muy baja humedad, menos de 8%. Semillas oleaginosas, cubos de caldo saborizantes.
Algunas sopas deshidratadas.
Discontinuo (SOXHLET)
Eter etílico, éter de petroleo, alcoholes
Extracción incompleta, usa alta temperatura, no puede usarse para estudio de ácidos grasos. No se puede aplicar a alimentos sometidos a algún tratamiento térmico ni a leche y derivados lácteos. Algunos tipos de derivados cárneos, frutas y verduras, algunos productos azucarados.
Automático (FOSS-LET FAT ANALYZER) solvente Tetracloroetileno Derivados cárneos

Extracción con mezcla de solventes

Hidrólisis acida previa a la extracción con solventes: Eter etílico, éter de petróleo No se recomienda ocupar el extracto lipídico en el estudio de ácidos grasos aunque algunos autores lo emplean. No recomendable en alimentos ricos en azúcares, productos lácteos. Método rápido, de amplia aplicación en diversos tipos de alimentos. Trabaja sobre muestra fresca. Debe aplicarse a todo alimento sometido a algun tipo de procesamiento o tratamiento térmico.
Hidrólisis alcalina previa a la extracción con solventes: Eter etílico, éter de petróleo. Equipo especial con tubos y centrifuga adecuada. Alternativa: usar embudos de decantación. Método de elección para leche y productos lácteos.
Método de Folch, Bligh y Dyer Cloroformo-Metanol Cierto costo en solventes. Re-extracción para purificación, debe conocerse el % de humedad Debe conocerse el % de humedad del del alimento para ajustarla al 80%. Extracción en frio, aplicable prácticamente a todo alimento. El extracto se puede usar para determinación de ácidos grasos,esteroles, etc. Son métodos rápidos.

Métodos volumétricos

Carbonización selectiva con H2SO4 concentrado Equipo especial Rápido. Se usó mucho para leche y derivados lácteos.

Otros métodos

Dispersión de la 1uz. Milkotester. Equipo especial Rápido. Leche cruda
Near Infrared Reflectance (NIR) Equipo especial de alto costo.
Requiere calibración
Cereales. Leche.
NMR Equipo especial de alto costo. Requiere calibración Semillas oleaginosas. Método muy rápido.

La derivatización puede realizarse para preparar acetatos, trimetilsililéteres, o butiratos.

El método de la Comunidad Europea purifica el residuo insaponificable por TLC antes de la derivatización. También se describen alternativas sin derivatizar.

El método es por cromatografía gas-líquida (GLC) en columnas de vidrio con fase OV 17, Se30, de 2 m, también se emplean columnas de sílica fundida de 12; 20; 30 m Se52, Se54 o equivalente.

El estándar interno puede ser 5 alfa colestano, o 5 alfa colestanol.

c) Método enzimático

Otro método para determinar colesterol es el método enzimático (7). El colesterol se oxida con colesterol oxidasa en presencia de agua oxigenada, catalasa y metanol, formándose finalmente una lutidina cuyo color se mide al espectrofotómetro a 405 nm. Las reacciones involucradas se señalan a continuación:

Producción y manejo de datos de composicion química de alimentos en nutrición

® formaldehído + acetilacetona + amonio

® Lutidina (el color se mide al espectrofotómetro a 405 nm).

4. Acidos grasos

El análisis de los ácidos grasos de cualquier alimento requiere de las siguientes etapas:

  1. Obtención de la materia grasa por método de extracción en frío con mezcla de solventes.
  2. Derivatización de los ácidos grasos.
  3. Análisis por cromatografía gas- líquido.

El primer punto ya fue tratado en métodos de extracción.

Se abordará a continuación los principales métodos de derivatización:

Al preparar los ésteres metílicos hay que considerar los siguientes aspectos que pueden afectar el resultado:

  1. Conversión incompleta de los lípidos de la muestra a ésteres metílicos de ácidos grasos.
  2. Cambios en la composición original de los ácidos grasos durante la esterifícación que puede originar formación de isómeros posicionales y/o geométricos.
  3. Formación de compuestos extraños que pueden confundirse con ácidos grasos.
  4. Contaminación y daño de la columna GLC proveniente de muestras contaminadas o de restos de los reactivos de derivatización.

Los métodos de derivatización se pueden dividir en cuatro categorías (8):

- catálisis básica
- catálisis ácida, básica
- diazometano
- otros métodos de esterificación

a) Catálisis básica

Metóxido de sodio en metanol anhidro

Ventajas

Rápido, puede efectuarse a temperatura ambiente. Convierte los triglicerídos o acilgliceroles directamente a ésteres metílicos (transesterificación).

No produce isomerización de dobles enlaces. No libera el aldehido del plasmalógeno. No transesterifica ni esfingolípidos ni colesterol.

Desventajas

No convierte los ácidos grasos libres a ésteres metílicos. Por lo tanto no sirve para muestras de materias grasas con elevada acidez.

Debe trabajarse en medio anhidro. La presencia de agua produce saponificación lo cual resulta en pérdida de ácidos grasos. El uso prolongado puede alterar la composición en ácidos grasos.

Alta concentración de álcali y alta temperatura puede llevar a la formación de ácidos grasos conjugados.

b) Catálisis ácido básica

HC1 en metanol 5% P/V
H2SO4 en metanol 1 a 2% V/V
Cloruro de acetilo en metanol
KOH en metanol y BF3 en metanol

Ventajas

Todos estos métodos convierten los acilgliceroles o triglicéridos y ácidos grasos libres en ésteres metílicos. El más popular tal vez es el BF3 20% en metanol por usar el primer procedimiento aceptado por AOCS.

El método de la AOAC saponifica con NAOH en metanol y luego esterifica con BF3 en metanol. Es un método rápido.

Desventajas

Forma compuestos ajenos o interferentes.

No es útil para aceites de semilla que contienen ácidos grasos inusuales como epoxi, ciclopropeno, insaturación conjugada, etc.

Reacciona con plasmalógenosformando aldehido.

Reacciona con colesterol formando colesterolmetiléster y colestadieno.

El reactivo es caro e inestable. Debe refrigerarse. El empleo de BF3 antiguo o concentrado produce pérdidas de ácidos grasos poliinsaturados.

Cloruro de acetilo en metanol

Ventajas

Presenta buenos resultados con leche y aceites vegetales sin extracción previa de los lípidos.

Comparable al BF3-metanol para transesterifícar los colesteril ésteres, no produce compuestos extraños.

Desventaja

No esterifica los ácidos grasos libres

c) Diazometano

Ventajas

Es un método rápido casi instantáneo a temperatura ambiente.

Esterifica los ácidos grasos libres en presencia de metanol.

El exceso de reactivo se elimina por evaporación bajo N2.

Desventaja

Reactivo muy tóxico. Se puede usar sólo si es estrictamente necesario. Es explosivo. Forma compuestos extraños reaccionando con dobles enlaces o grupos carbonilos.

d) Otros métodos de esterificación

Se han buscado nuevos reactivos con el objeto de obtener mas rápidamente los ésteres metílicos de los ácidos grasos.

1. Utilización, de sales cuaternarias de amonia

Se han usado sales cuaternarias de amonio fuertemente básicas como:

- hidróxido de m-trifluorometilfeniltrimetilamonio (TFMPTAH)
-

hidróxido de trimetilfenilamonio (TMPAH)

-

hidróxido de trimetilamonio (TMPAH)

Ventajas

Se produce la transesterificación de los acilgliceroles o triglicéridos a. ésteres metílicos de ácidos grasos por pirólisis en la columna GLC.

La transesterificación se efectúa en una etapa, no se requiere etapa de extracción. De especial importancia en ácidos grasos de cadenas cortas.

Se podría determinar separadamente la composición en ácidos grasos de los triglicéridos, de los ácidos grasos libres y del total.

Desventajas

La muestra debe ser neutralizada antes del análisis por GLC. La alta alcalinidad y alta temperatura de la columna para la metilación pirolítica produce isomerización de dobles enlaces dando ácidos grasos conjugados. Algunos productos de ruptura de estos reactivos pueden interferir con el análisis de ácidos grasos de cadena mediana.

2. Transesterificación directa

Cloruro de acetilo en metanol

Ventajas

La extracción y aislación del lípido se efectúa en una sola etapa.

La muestra se coloca en un solvente, se agrega cloruro de acetilo en metanol y se obtiene los ésteres metílicos de los ácidos grasos. Se han investigado diferentes solventes.

Se ha aplicado a tejidos, plasma, alimentos, leche, grasa de leche, etc. Se ha mostrado más eficiente comparado con el método tradicional de extracción de Folch.

3. Metanol caliente en HCL

Ventaja

Se aplicó a hojas y los ésteres metílicos de los ácidos grasos se extrajeron con solvente.

Desventaja

Se obtuvieron valores más bajos que los obtenidos por métodos convencionales.

Guanidina y sus derivados alquilados en metanol

Ventajas

Se produce una completa metanólisis de los aceites y se convierte los acilgliceroles o triglicéridos y ácidos grasos libres en ésteres metílicos.

Los ácidos grasos forman la sal guanidinacarboxilato que en presencia de exceso de metanol forma los ésteres metílicos. Este método se ha comparado satisfactoriamente con el método Ce 2-66 con 20% BF3 en metanol de la AOCS.

El reactivo no es caro, no produce isomerización de dobles enlaces. Es un método rápido, bastan 2 minutos en baño de agua hirviendo.

Desventaja

El exceso de reactivo debe ser extraído antes que la muestra se inyecte en la columna GLC.

4. Metilación con metanol catálisis básica y ácida

La metilación se efectúa con metilato de sodio, calentando a reflujo 10 minuos. Se enfría y luego se agrega la solución metanólica de H2SO4 hasta pH ácido, viraje de la fenolftaleína, luego se calienta a reflujo por 20 minutos, se enfría. Se agrega el hexano para la extracción de los ésteres metílicos.

5. Preparación de ésteres butílicos

Se prefiere para el análisis de ácidos grasos de cadena corta presentes en grasa de leche.

Se usa BF3 al 12,5 % en butanol

Ventaja

Da mejores recuperaciones de estos ácidos grasos de cadena corta.

Preparación de ésteres metílicos

La Comunidad Europea (9) señala los siguientes métodos para la preparación de los ésteres metílicos.

  1. En caso de materias grasas que contengan ácidos grasos inferiores a C12, sólo podrán usarse los procedimientos en tubo cerrado o con sulfato de dimetilo.
  2. Cuando se trata de materias grasas con acidez superior al 3%, sólo podrán usarse los procedimientos con mezcla de metanol y ácido clorhídrico o con sulfato dimetílico.
  3. En el caso de determinación de isómeros trans, sólo se usarán los procedimientos con metilato de sodio o con sulfato dimetílico.
  4. El procedimiento que emplea mezcla de metanol, hexano y ácido sulfúrico se empleará para pequeñas cantidades de materias grasas, por separación mediante cromatografía en capa fina.

Recomendación: no se tomará en cuenta la materia insaponificable cuando no supere el 3%. En caso contrario, los ésteres metílicos se prepararán a partir de los ácidos grasos.

Cromatografía gas-líquido de los ésteres metílicos. Método de la Comunidad Europea(9)

Señala las siguientes alternativas:

  1. Columna empacada de vidrio o acero inoxidable 1 a 3 metros de largo, 2 a 4 mm diámetro interno (D.I.) Soporte inerte: tierra de diatomeas lavada al ácido y silanizada. Fase liquida poliés-teres o cianosilicona entre 5 y 20%.
  2. Columna capilar de vidrio o sílica fundida, D.I. 0,2 y 0,8 mm, longitud 25 metros. Fase líquida tipo polietilenglicol 20.000, poliésteres, polisiloxano polar (cianosiliconas).
    Espesor de film entre 0,1 y 0,2 Tm
  3. Análisis cualitativo
    Como referencia: Se toma el pico del estearato de metilo.
  4. Análisis cuantitativo, se puede aplicar: normalización interna, patrón interno, factores de corrección.

Otras consideraciones en relación a la cromatografía gas-líquido de ésteres metílicos de ácidos grasos

El Dr. Robert Ackman ha propuesto que las fases de tipo Carbowax 20M sean utilizadas como patrones de referencia para columnas capilares de sílica fundida en ensayos interlaboratorios. También ha trabajado bastante con Silar CP, una fase que es ligeramente más polar que Carbowax 20M. FFAP, Supelcowax-10 y SP 1000 son muy similares al Carbowax 20M en columnas de sílica fundida.

Fases estacionaria con enlace cruzado y unidas (bonded) se han mostrado satisfactorias en la resolución de ciertos pares críticos.

En el caso de columnas empacadas, tres columnas que contienen 15% EGSS-Y, EGSS-X y Silar 10C sobre soporte silanizado 100-120 mesh, lavado al ácido abren un amplio rango de polaridad para el análisis de la mayoría de los ácidos grasos poliinsaturados.

Gas portador

El hidrógeno tiene ventajas como gas portador para las columnas capilares de tubo abierto en términos de eficiencia. Problema: detectar pérdidas o escapes permanentemente por seguridad. El helio es más seguro pero más costoso en diversos países.

Los gases deben pasarse a través de trampas de oxígeno y humedad antes de la columnas para dar mayor estabilidad a la línea base cuando se trabaja a altas sensibilidades y para prolongar la vida de la columna. Para columnas empacadas, nitrógeno con menos de 5 ppm de oxígeno es adecuado. El argón es más caro que el nitrógeno y contiene menos oxígeno.

El horno

Deberá tener un dispositivo altamente sensible para controlar la temperatura, de modo que sea uniforme en todas las regiones.

Uso de patrones para identificación

Existen en el mercado mezclas patrones conteniendo cantidades conocidas de ésteres metílicos de ácidos grasos saturados, monoenoicos y polienoicos. Sirven para efectos de identificación y cuantificación.

Para identificación se usan los tiempos de retención corregidos o relativos de los patrones en relación a los componentes de la muestra, corridos en la misma columna y bajo idénticas condiciones. La comparación se debe hacer en dos columnas con fases líquidas de polaridad diferente. El largo de cadena equivalente es otra posibilidad de identificación.

Como algunos lípidos de origen animal y marino contienen mezclas complejas de ácidos grasos, se recomienda usar algunas materias grasas de composición conocida como: aceite de hígado de bacalao, materia grasa de testículos de bovino y porcino, lípidos de hígado de rata, etc.

Valores para ácidos grasos

Los valores para ácidos grasos individuales, generalmente se expresan como porcentaje de ácidos grasos en relación al total, ya que esta es la forma más común de presentación analítica.

A nivel de base de datos se necesita la información por 100 g de alimento. Por lo tanto, se han publicado factores de conversión derivados de la proporción de los ácidos grasos presentes en el lípido total para convertir porcentajes de ácidos grasos a ácidos grasos por 100 g de alimento (3).

Conclusiones generales

  1. Asegurarse que el método de preparación de los ésteres metílicos es el adecuado para el tipo de muestra.
  2. Los métodos deben seguirse de acuerdo a las especificaciones establecidas.
  3. El empleo de reactivos nuevos sin extracción del reactivo de transesterificación debe ser cuidadoso en cuanto a su efecto sobre la columna.
  4. La exactitud del método debe ser comprobada con estándares primarios de ácidos grasos de cadena corta, larga y poliinsaturados.

BIBILIOGRAFIA

  1. AOAC. 1990. Official Methods of Analysis. 15 ed. USA.
  2. Chile. Instituto Nacional de Normalización. 1988. NCh 484 CR 88; Determinación de la humedad y materias volátiles en granos o semillas oleaginosas. Santiago.
  3. Greenfield, H. and Southgate, D.A.T. 1992. Food Composition Data. Production, Management and Use. London, Elsevier Applied Science.
  4. Bligh, E.G. andDyer, W.J. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. (Can. J. Biochem. and Physiol. 37: 917- 917).
  5. Folch, J.; Lees, M. and Stanley, G.H.S. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. (J. Biol. Chem. 226: 497-509).
  6. Determinación de la composición y del contenido de esteroles mediante cromatografía de gases con columna capilar. 1991. (Diario Oficial de las Comunidades Europeas L248/15).
  7. Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis. 1989. Germany, Boehringer Mannheim.
  8. Christie, W.W. 1989. Gas Chromatography and Lipids. Scotland, The Oily Press. AIR.
  9. Materias grasas. Determinación de ácidos grasos por cromatografía gaseosa. (UNE55 037-3).

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