Por:
Emilio Castro C. M.Sc.
Laura Avila M. Quím.
Fundación Chile
El análisis de proteína cruda no nos da ningún indicio en cuanto a la digestibilidad de un suplemento de proteína.
Por supuesto, si una fuente de proteína ha sido procesada inadecuadamente y no puede ser bien digerida por el animal, contribuirá muy poco a su crecimiento y a la producción.
El análisis de digestibilidad por pepsina es un ejemplo de un procedimiento de control de calidad que intenta proporcionarnos información adicional en relación al valor nutricional verdadero de las fuentes de proteína, especialmente aquellas de origen animal.
Se revisarán los fundamentos de este análisis, el método estandard A.O.A.C. y la modificación Torry que se ha introducido para darle más valor a los resultados de esta determinación.
Dado que el análisis de proteína cruda no suministra información alguna en cuanto a la digestibilidad de una fuente de proteína, un procedimiento de laboratorio para determinar la digestibilidad sería extremadamente útil.
Este es precisamente el objetivo de la prueba de determinación de la digestibilidad por pepsina.
La pepsina es una enzima digestiva que en la presencia de un medio ácido desdobla las proteínas del alimento.
Colocando una muestra de la materia prima que se desea analizar en una solución que contenga pepsina y midiendo qué cantidad de proteína es digestible, podemos estimar el valor nutritivo relativo de dicha materia prima. Es muy importante tener presente la palabra “relativo”.
Es muy importante tener en cuenta que en el tracto digestivo existen otras enzimas que también ayudan a desdoblar las proteínas y que las condiciones son mucho más complejas que las que pueden simularse en un laboratorio. Por lo tanto, los resultados de procentaje de digestibilidad en pepsina que obtengamos mediante este método nunca deberán confundirse con la digestibilidad verdadera de la materia prima. Por ejemplo, supongamos que analizamos dos muestras de harina de pescado de dos proveedores diferentes. La muestra del proveedor “A” tiene un valor de pepsina de 80% y la del proveedor “B” sólo 70%. Esto no quiere decir que el animal solamente será capaz de digerir 80 o 70% de estas harinas respectivamente. Simplemente, podemos concluir que el proveedor “A” procesa mejor sus harinas de pescado. Si el contenido de proteína cruda de las dos harinas es similar, haremos bien en comprar el producto “A” y dejar el producto “B” para alguien en cuyo laboratorio se realice solamente el análisis de proteína cruda (Dale, 1984).
A nivel internacional distintos productores y traders de harinas de pescado han establecido sus propias especificaciones de calidad para las harinas de pescado y dentro de estas especificaciones la digestibilidad de la pepsina constituye un análisis fundamental (ver Tabla 7.1.)
| C.A.P. | C.L.P. | C.S.F. | |
|---|---|---|---|
| Proteínas | 68% mín. | 67% mín. | 65% mín. |
| Materia grasa | 10% máx. | 12% máx. | 14% máx. |
| Humedad | 10% máx. | 10% máx. | 10% máx. |
| 6% mín. | 6% mín. | - | |
| Sal | 3% máx. | - | - |
| Arena | 1% máx. | 1% máx. | 2% máx. |
| Sal y arena | - | 5% máx. | 5% máx. |
| T.V.N. | 60mg/100gr N máx. | - | - |
| Digestibilidad | 94% mín. | 92% mín. | - |
| Antioxidante | 100 ppm mín. | 100 ppm mín. | 100 ppm mín. |
Fuente: FULMAR (Comunicación personal, 1991)
Si deseamos usar el análisis de pepsina para detectar diferencias en digestibilidad entre muestras de ingredientes similares o parecidos, la prueba debe ser lo suficientemente sensible como para descubrir estas diferencias de calidad y evaluar el cuidado utilizado en su procesamiento industrial. En este sentido es necesario señalar que si adicionamos un exceso de pepsina al momento de llevar a cabo el análisis, casi toda la proteína será digerida independientemente de su calidad. Si todos los valores del análisis de pepsina exceden un 85%, son de valor limitado para el nutricionista para decidir qué proveedor está haciendo el mejor trabajo durante el procesamiento. En este sentido, sería conveniente usar una concentración menor de pepsina, de tal forma que por ejemplo digiera 80% de la proteína de una materia prima de buena calidad que fue adecuadamente producida y sólo un 60% de la proteina de una materia prima que ha sido dañada durante el procesamiento. Los fabricantes de subproductos de origen animal lógicamente que prefieren los niveles excesivos de pepsina porque les permiten que los posibles descuidos ocurridos durante el procesamiento sean más difíciles de detectar (Dale, N. 1984).
El método A.O.A.C., recomienda emplear una concentración muy alta de pepsina (0.2%) con lo cual casi toda la proteína será digerida independientemente de su calidad y se pierde la sensibilidad para detectar el efecto nutricional negativo de un inadecuado sobrecalentamiento como puede ocurrir en la fabricación de harina de pescado o de carne (ver Anexo 7.1.) El método Torry por su parte, recomienda emplear una concentración débil de pepsina (0.0002%) incrementando la sensibilidad del análisis (ver Anexo 7.2.).
Para que la pepsina pueda digerir las proteínas, se requiere de un pH bajo. En el estómago, la pepsina (en forma de proenzima o pepsinógeno) y el ácido clorhídrico son secretados simultáneamente. En el análisis de digestibilidad en pepsina, se añade el mismo ácido a la solución de pepsina. Una pregunta que se debería formular es: ¿Cuánta proteína digiere el ácido sólo, independientemente de la pepsina o más específicamente, cuánto nitrógeno se solubiliza con el ácido? Esta pregunta es muy importante porque si el ácido de la solución pepsina-ácido digiere una parte de la proteína que está siendo evaluada, la verdadera digestibilidad en pepsina será sobreestimada. En vista de que el objetivo del análisis de digestibilidad por pepsina es distinguir entre harinas de diferente calidad la cual presenta un mayor valor nutricional, cualquier modificación en el procedimiento analítico que acentúe las diferencias de digestibilidad entre las harinas aumentará el valor de esta prueba. La corrección del efecto digestivo del ácido se hace incluyendo con cada muestra que está siendo analizando un “control” en donde sólo se añade ácido (sin pepsina) a la muestra. El porcentaje de digestibidad se determina en la forma habitual para los tratamientos de “pepsina + ácido” y “Solamente ácido”. El valor final de “nitrógeno digestible en pepsina corregida para ácido” se calcula de la siguiente forma:
100 (P - A) - (100 - A)
en donde P = porcentaje de nitrógeno digestible en pepsina y A = porcentaje de nitrógeno soluble en ácido (Dale, 1984).
En orden de evaluar el coeficiente de variación de resultados para este análisis entre distintos laboratorios, se seleccionaron al azar 10 muestras de harinas de pescado de distinto origen y se analizaron en 5 diferentes laboratorios utilizando una solución de pepsina de 0.02% W/V más diluida que el método A.O.A.C.(1960) y ácido hidroclórico al 90%. Los resultados se entregan en la Tabla 7.2.
| Labor. | Noruega | S. Africa | Francia | Angola | U.K. | Promedio |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Muestra | Digestibilidad(%) | |||||
| 1 | 95.0 | 97.0 | 92.9 | 97.7 | 98.0 | 96.1±3.8 |
| 2 | 98.1 | 98.0 | 93.3 | 99.9 | 99.8 | 97.8±4.8 |
| 3 | 96.4 | 98.9 | 93.6 | 97.6 | 100.1 | 97.3±4.4 |
| 4 | 96.8 | 98.5 | 91.5 | 99.3 | 98.1 | 96.8±5.6 |
| 5 | 96.2 | 99.1 | 91.5 | 99.5 | 99.0 | 97.1±6.0 |
| 6 | 94.9 | 97.9 | 95.1 | 98.4 | 98.0 | 96.9±3.0 |
| 7 | 94.1 | 97.1 | 92.2 | 96.6 | 96.6 | 95.2±3.6 |
| 8 | 94.2 | 97.9 | 95.5 | 98.8 | 96.8 | 96.6±3.2 |
| 9 | 90.1 | 93.6 | 86.4 | 93.4 | 92.5 | 91.2±5.4 |
| 10 | 95.4 | 95.1 | 90.3 | 99.5 | 98.5 | 95.8±6.4 |
Fuente: Barlow, S.M. (IAFMM) (Comunicación personal, 1990)
Se determinó que para la determinación de digestibilidad por pepsina el coeficiente de variación de los resultados entre laboratorios para cada muestra fue tan alto como 6.7% Incluso, más con una muestra las diferencias de digestibilidad entre laboratorios fue tan alta como 9.2%
Este factor tiene una influencia gravitante en los resultados obtenidos con la prueba de digestibilidad. La molienda de la muestra lleva a un incremento en la solubilidad. Incluso más, el almacenaje inadecuado en muestras también afectá los resultados al repetir el análisis sobre una misma muestra.
El uso de agitadores más eficientes actualmente disponibles lleva también a un incremento en la digestibilidad.
Las observaciones anteriores plantean la necesidad de una actualización exacta de la técnica.
No se adjunta bibliografía, ya que con la excepción del método AOAC descrito, toda la información entregada en este trabajo proviene de contactos personales establecidos en estos últimos 5 años.
| Muestra | |
| ↓ | |
| Extracción con éter dietílico | |
| ↓ | |
| Muestra seca desgrasada | |
| ↓ | |
| 150 ml sol. pepsina 0.2% en HCL 0.07 5 N | Previamente calentado a 42–45°C |
| ↓ | |
| Incubar con agitación 16 horas a 45°C | |
| ↓ | |
| Filtrar y lavar con H2O y acetona | |
| ↓ | |
| | | | |
| Precipitado | Filtrado |
| | | | |
| Kjeldahl | |
Método: Torry modificado (Torry Research Station)
Objetivo: determinación de la proteína digestible en pepsina.
Etapas:
| Muestra original | Preparación de la muestra |
| ↓ | |
| Molienda, tamiz ASTM #40 (0.425mm). | |
| ↓ | |
| Pesaje, precisión 0.1 mg (balanza analítica). | |
| ↓ | ||
| Digestión | ||
| Proceso de digestión | Incubar con agitación 16 horas a 45°C | |
| Muestra HCL | Muestra + pepsina | |
| (0.0002%) - HCL | ||
| ↓ |
| Incubación: 16 horas a 45°C (incubador orbital). |
| ↓ |
| Filtración al vacío - Lavado (Büchner) |
| ↓ | ||
| Determinación de N no digerible | ||
| N residual HCL | Nresidual pepsina | |
| Método Kjeldahl | |
| ↓ | |
| Mineralización | Digestión con H2SO4 concentrado y catalizador. |
| ↓ | |
| Destilación | Destilación con arrastre por vapor (Büchi 323). |
| ↓ | |
| Destilado recibido en ácido bórico con indicador Taschiro. | |
| ↓ | |
| Cuantificación del amonio liberado | Titulación con H2SO4 (titulador automático). |
| ↓ | |
| % Nitrógeno. | |
Cálculos (Fuente: comunicación personal, 1992):
% Nitrógeno: 
a: ml gastados en titulación
N: normalidad H2SO4
m: peso muestra en gramos
% Digestibilidad en pepsina: 
