Por:
Emilio Castro C.M.Sc.
César Sepúlveda S. Bq.
Fundación Chile
El color de la carne de los salmónidos anádromos se debe a la absorción y fijación de pigmentos carotenoides oxigenados en su carne. Entre ellos, el pigmento llamado astaxantina es el que se encuentra en mayor abundancia en el salmón silvestre, mientras que en las especies cultivadas es posible encontrar una mayor variedad como resultado de la inclusión de una gama de ingredientes y fuentes de pigmentación en las dietas artificiales. Es así que en especies cultivadas se encuentran básicamente astaxantina y cantaxantina y en concentraciones tisulares mucho menores, adenorrubina, zeaxantina, luteina y otros.
Figura 26.1. Estructura de algunos carotenoides (Torrisen, O. J.; Hardy R. W. y Shearer D. K., 1989)
Los pigmentos presentes en los salmónidos:
Pertenecen a los carotenoides al igual que los carotenos. Sin embargo, se diferencian de éstos por contener oxígeno en su molécula y consecuentemente presentar una mayor polaridad.
Corresponden a derivados terpénicos caracterizados por poseer una cadena alifática que presenta, un sistema de dobles enlaces conjugados, grupos metílicos insertados y grupos hidroxílicos y cetónicos que les permiten diferenciarse de otros carotenoides.
La presencia de los dobles enlaces les confieren las siguientes propiedades:
Presentan una gran capacidad de absorvancia entre los 400 y 500 nm del espectro electromagnético y de absorber energía luminosa.
Tienen la posibilidad de formar esterioisomeros cis y trans y por lo tanto, de poder reorganizarse molecularmente formando innumerables derivados con diferentes valores pigmentantes.
Son solubles en aceites y presentan una adecuada solubilidad en acetona, dimetil sulfóxido, metanol, etc, dado su carácter polar.
Los esteroisómeros trans y cis de los pigmentos carotenoides de los salmónidos presentan diferentes valores pigmentantes.
Se ha asignado un 100% de biodisponibilidad para la forma trans y cero para la forma cis (Medina, J.C. 1992).
La molécula de astaxantina tiene 2 átomos de carbono asimétricos equivalentes en las posiciones 3 y 3', pudiendo formar 3 isómeros ópticos diferentes: (3R, 3'R), (3R, 3'S)= (3S, 3'S).
Los isómeros ópticos tienen propiedades químicas iguales y coinciden en la mayoría de las propiedades físicas, diferenciándose en su rotación específica, es decir, la dirección en que desvían el plano de la luz polarizada.
Se cree que sólo los enantiómeros (3R, 3'R) y (3S, 3'S) de la astaxantina son producidos naturalmente (Schiedt, K. et al, 1991).
Se ha demostrado que la astaxantina sintética corresponde a una mezcla racémica en la siguiente proporción: (3R, 3'R): (3R, 3'S): (3S, 3'S) = 25:50:25 (Vecchi and Muller, 1979; Storebakken et al., 1985).
Existen evidencias experimentales que el 100% de la astaxantina de la Phaffia rhodozyma corresponde a la forma (3R, 3'R).
La evaluación del color de la carne de los salmones se puede realizar por medio de métodos de análisis sensorial con panelistas entrenados en tests descriptivos o comparativos, a través de la comparación del color de muestras de peces con colores estandarizados, por medio del análisis instrumental basado en la luz refractada de muestras de peces, o por el análisis cuantitativo de los pigmentos por HPLC.
El método más utilizado hasta la fecha por la industria salmonera chilena es la evaluación por medio de Tabla de Colores que corresponde a una comparación visual de esta tabla con la muestra respectiva. Esta tabla fue desarrollada especialmente para salmón Atlántico pigmentado con astaxantina y se usa tanto para filetes como para secciones de salmón. La utilización de dicha tabla dobiera efectuarse bajo condiciones específicas de luminosidad, lugar de evaluación en el pez y de contraste. Su principal limitante es que se trata de un método subjetivo, que depende de la apreciación visual del observador y no cuantitativo. Este método se recomienda para evaluar el nivel de pigmentación en muestras de 10 a 15 peces y no en peces individuales. Las publicaciones de Torrisen señalan que el método presenta una alta correlación (R2 = 0.99) con la concentración de pigmentos determinados a nivel tisular en una población.
a) Descripción
Compara visualmente el color de la carne del pez con colores estandarizados en una tabla: secciones (1–8) y filetes (11–18).
b) Limitaciones
Este otro método basado en la luz refractada se considera más objetivo y preciso que el anterior, dado su carácter instrumental. En él se utiliza un colorímetro de refractancia, el cual entrega información basada en un sistema de valores definido para este efecto por la Comisión Internacional de Iluminación (CIE) Los valores entregados se basan en un espacio cromático en coordenadas rectangulares (L*a*b) junto con otro en coordenadas cilíndricas (L*H*C), dichos valores representan a la luminosidad o claridad, el tono y la cromaticidad respecto a los colores componentes rojo, amarillo y azul. Diversos investigadores han trabajado en tratar de definir la correlación de estos valores con el grado de pigmentación y con la Tabla de Colores, describiendo distintas correlaciones.
El análisis instrumental mediante colorimetría de refractancia presenta las siguientes limitaciones y ventajas:
a) Limitaciones
b) Ventajas
Un logro particularmente importante a partir de 1975 en el análisis químico instrumental lo constituyó el uso común de la cromatografía líquida de alta resolución en la industria de alimentos. La cromatografía permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos químicos en la medida que son solubles o reaccionan con algún compuesto. Los pigmentos carotenoides de los salmónidos tienen propiedades de este tipo que hacen aplicable este método.
Cabe señalar que la cromatografía líquida de alta resolución conocida como HPLC, difiere sólo en detalles de la clásica.
El procedimiento general de un análisis cualquiera dentro de la cromatografía líquida incluye tres etapas fundamentales:
En nuestro caso particular, dado que comercialmente no existen estándares tanto para astaxantina como para cantaxantina, es necesario hacer una preparación de los estándares a partir de los productos comerciales Carophyll Pink (astaxantina 8%) y Carophyll Red (Cantaxantina 10%) y una calibración espectrofotométrica para conocer su concentración real (Gross, 1992)
Las etapas de esta calibración son:
Pesar muestra de Carophyll Pink o Carophyll Red.
Disolver la muestra en agua destilada tibia hasta lograr una suspensión homogénea.
Dejar enfriar a temperatura ambiente y aforar a volumen conocido. Dejar reposando por una hora a lo menos (o toda la noche) para que decante el almidón que recubre a los pigmentos.
Tomar una alicuota de cada suspensión.
Diluir con n-hexano y leer la absorbancia de las soluciones a 470 nm con n-hexano como blanco. El coeficiente de extinción para la astaxantina es de 1,910 (Gross, 1992) y para la cantaxantina es de 2,200 (Gross, 1992)
Una vez completa la etapa de calibración se calcula la concentración real de cada pigmento y se preparan las concentraciones adecuadas y diluidas en una mezcla metanol/agua para inyectar en el cromatógrafo. El rango aconsejable de estudio deberá ser entre 0.1 a 4.0 μg/ml.
(i) Harinas de pescado y/o pellets
Este procedimiento es válido para muestras de pellet o harina de pescado que contengan Carophyll (Red o Pink), con Phaffia rhodozyma o la levadura simplemente (Sedmark y cols., 1990).
En síntesis considera las siguientes etapas:
Moler en molino si la muestra es pellet.
Pesar exactamente la muestra de la harina o Phaffia.
Hidratar, en el caso de la phaffia, para facilitar su disgregación.
Agregar el dimetilsulfóxido previamente calentado.
Agitar vigorosamente, incubar en calor y centrifugar.
Tomar una alicuota del sobrenadante y diluir en volumen conocido con mezcla MeOH/H2O.
Volver a centrifugar e inyectar en el cromatógrafo del sobrenadante.
(ii) Tejido muscular de salmón o trucha
Este método también es posible de utilizar sobre muestras de harina de krill (y otros crustáceos), paprika y otros vegetales en polvo. En general, la metodología se resume en los siguientes pasos:
Moler y homogenizar la muestra de tejido en un picadora de cocina cuando sea pertinente.
Pesar en un tubo exactamente la muestra.
Extraer con pequeños volúmenes de acetona por agitación vigorosa en un vórtex o por ultrasonido (hacer tantas extracciones como sea necesario).
El sobrenadante llevarlo a un segundo tubo donde se juntan los extractos.
Llevar a volumen conocido una mezcla de MeOH/H2O.
Centrifugar e inyectar el sobrenadante directamente en el cromatógrafo.
La fase de extracción puede ser optimizada utilizando un sistema de extracción en fase sólida acoplada a vacío.
(iii) La determinación cromatográfica considera las siguientes condiciones generales
| Fase móvil: | mezcla MeOH/H2O |
| Fase estacionaria: | columna C-8 4 × 250 mm |
| Vol. inyección: | 20 μl |
| Temperatura: | ambiente |
| Detector: | isible, 470 nm |
La técnica cromotográfica anteriormente descrita utiliza una fase móvil relativamente polar constituida por una gradiente de metanol y una fase estacionaria apolar consistente en una columna en fase inversa C8. No se describen limitaciones para ella, si las siguientes ventajas:
Eluye el β-caroteno en un tiempo razonable, separándolo de los oxicarotenoides del salmón.
Permite separar los isómeros cis y trans tanto de la astaxantina como cantaxantina.
Otros investigadores han propuesto otras modalidades cromatográficas algo distintas con el fin de evaluar otros aspectos de la pigmentación de los salmónidos. Es así como:
Vecchi M. y Muller R.K. (1979) desarrollaron un método HPLC diferente a los modos de separación normal y reversa. Esta técnica permite separar los isómeros configuracionales de la astaxantina previo a sus esterificación con ácido campanico y posterior separación de los correspondientes diésteres en una columna de nitrilo (CN) por HPLC.
Makoa et al. (1985) por su parte propusieron un método HPLC que permite la separación directa de los carotenoides diasteroméricos de la astaxantina utilizando la columna Sumipax OA — 2000 chiral.
Estos métodos presentan las siguientes limitaciones: no se recomiendan como técnicas de rutina ya que, en el primer caso, los pasos adicionales que involucra la preparación de los esteres del ácido campánico pueden afectar su exactitud y, en el segundo caso, el tiempo del análisis es demasiado largo (90 minutos).
La importancia que tiene la pigmentación de los salmónidos tanto por su costo como por ser un factor clave de comercialización determina la imperiosa necesidad de conocer la concentración de los pigmentos carotenoides presentes en las distintas fuentes de pigmentación, alimentos balanceados y tejidos de los peces.
Las metodologías analíticas utilizadas para este propósito presentan diversas limitaciones y desventajas. Sin embargo, el desarrollo reciente de técnicas cromatográficas de, alta resolución, velocidad, sensitividad, reproducibilidad y operación, nos permite ofrecer actualmente métodos válidos de evaluación y certificación de pigmentación para la Industria Salmonera.
Buchwald, M. y Jencks, W.P. Optical properties of astaxanthin and aggregates. Biochemistry Vol. 7, No2, February 1968.
Fisher, C. and Kocis, J.A. Separation of Paprika pigments by HPLC. J. Agric. Food Chem. 35:57–59, 1987
Gross, R.W. Comunicación personal, 1992.
Lambertsen, G. and Braekkan, O.R. Method of analysis of astaxanthin and its occurrence in some marine products. J.Sci. Fd. Agric. 22: 99–102, febrero 1971.
Sedmak, J.J., Weerasinghe, D.K. and Jolly, S.O. Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. Biotechnology Techiques Vol. 4(2): 107–112, 1990.
