De todas las mediciones de la calidad de un lote de semilla, ninguna tiene tanta importancia como la que sirve para determinar la germinación potencial de las semillas (Bonner 1974). Los ensayos de germinación que se efectúan en laboratorio tienen por finalidad principal estimar el número máximo de semillas que pueden germinar en las condiciones óptimas. La utilización de condiciones ideales normalizadas en el laboratorio, como las que prescribe la ISTA, garantiza que los resultados obtenidos con un determinado lote en un laboratorio sean idénticos con los obtenidos en cualquier otro laboratorio de ese mismo u otro país. Para las semillas que se mueven por el circuito del comercio internacional es muy útil disponer de una norma común para evaluar el potencial de germinación. Por el contrario, está claro que los resultados que se obtienen en las condiciones ideales controladas en el laboratorio no son directamente aplicables sobre el terreno, en el vivero, donde sólo se puede ejercer un control limitado sobre las condiciones ambientales. Cada viverista debe aplicar su propio factor de corrección, derivado de su experiencia a lo largo de los años, para convertir el potencial de germinación de un lote tal como viene determinado por los ensayos de laboratorio en la germinación efectiva sobre el terreno que puede esperar en las condiciones locales de su vivero.
En el otro extremo, hay viveristas que, antes de efectuar una siembra en gran escala, prefieren efectuar su propio ensayo de germinación en su vivero. Los resultados de estos ensayos deben ser directamente aplicables a siembras ulteriores del mismo lote en el mismo vivero, pero no tienen por qué serlo a otros viveros. No obstante, a veces no hay tiempo suficiente para efectuar ensayos de germinación antes de la siembra principal, y los administradores de grandes viveros operacionales pueden ser reacios a iniciar una investigación en pequeña escala.
Entre ambos extremos se encuentra el caso de la pequeña estación de investigaciones silvícolas que carece de los medios de laboratorio necesarios para observar las prescripciones de la ISTA en materia de ensayos, pero que somete a ensayos de germinación en el vivero a las partidas de semilla a granel antes de distribuirlas entre proyectos de forestación repartidos por todo el país. También en este caso el ingeniero forestal o el viverista local han de aplicar su propio factor de corrección para convertir las cifras de germinación efectiva obtenidas en el vivero de investigación en las cifras de germinación que cabe esperar en su vivero operacional de gran tamaño.
La descripción que figura a continuación se basa en gran parte en la de (Turnbull 1975d). Se ajusta a las Reglas de la ISTA (1976), aunque algunos de los principios son igualmente aplicables cuando la falta de equipo o de personal capacitado obliga a utilizar métodos más sencillos.
La germinación se define como el surgimiento y desarrollo, a partir del embrión de la semilla, de las estructuras esenciales que indican la capacidad de la semilla para producir una planta normal en condiciones favorables (Justice 1972, ISTA 1976). La germinación se expresa como el porcentaje de semillas puras que produce plántulas normales o como el número de semillas que germinan por unidad de peso de la muestra.
En el laboratorio, las condiciones ambientales, como la humedad, la temperatura, la ventilación y la luz, han de ser no sólo lo bastante específicas para iniciar la germinación, sino también favorables para el desarrollo de las plántulas hasta una fase en la que puedan identificarse los tipos normales y anormales.
Con pocas excepciones, todos los ensayos de germinación deben efectuarse con semillas puras separadas mediante el ensayo de pureza. Se mezcla bien la semilla pura y se cuenta aleatoriamente en réplicas. Después se espacian de manera uniforme sobre el substrato del ensayo. Normalmente un ensayo consta de 400 semillas en 4 réplicas de 100 semillas cada una, pero, si 100 semillas son demasiadas para el substrato de que se dispone, entonces las replicaciones pueden subdividirse en un número mayor de réplicas más pequeñas, de 50 ó 25 semillas cada una (Bonner 1974). Se recomienda de manera general dejar entre las semillas entre 1,5 y 5 veces la anchura o el diámetro normal de la semilla, para reducir el riesgo de que se desarrollen mohos de hongos (Bonner 1974, Justice 1972).
Las excepciones son las especies que tienen la semilla muy pequeña, pues en ellas es imposible (algunas especies de Eucalyptus) o muy difícil (Alnus, Betula, Populus, Salix) separar la semilla de la materia inerte o granzas que la acompañan. En estos casos el ensayo se efectúa con el mismo número de réplicas, pero éstas son de igual peso y no de igual número de semillas (véase las páginas 322–323).
El recuento de las semillas para llevar a cabo ensayos de germinación puede facilitarse empleando tableros contadores como los descritos en las páginas 293–294.
El tipo de germinador que se va a emplear puede seleccionarse según la clase y la cantidad de semillas que van a ser objeto del ensayo; será aceptable siempre que pueda ofrecer un control adecuado de las condiciones prescritas en materia de temperatura, humedad y luz.
Los germinadores tienen tamaños muy variables, desde pequeñas o portátiles unidades individuales hasta cámaras de germinación en las que una persona puede estar de pie, pasando por armarios de diversas dimensiones y por las grandes masas de germinación del tipo Jacobsen de Copenhague. Los principales tipos que recomienda la ISTA son los siguientes:
Aparatos de Jacobsen y Rodewald. En Europa es de uso habitual un germinador denominado aparato de Jacobsen o cubeta de Copenhague. Se trata de una cubeta con agua cuya temperatura puede controlarse mediante termostatos. Las semillas se distribuyen encima de un papel y se colocan sobre unas tiras metálicas o de vidrio que están colgadas a unos 5–7 cm por encima de la cubeta; bajo el substrato hay unas mechas de papel o algodón que pasan por unos orificios hasta llegar al agua que está debajo. El contenido de humedad del substrato puede ajustarse modificando el nivel del agua, y también aumentando o reduciendo la distancia que hay entre el semillero y el agua (Kamra 1968).
La humedad se mantiene alta en torno a la semilla, bien cubriendo toda la cubeta con una tapa transparente, bien colocando un embudo de plástico invertido, con un orificio en el extremo cónico, encima de cada plataforma de germinación. Aunque este aparato puede estar expuesto a la luz natural, suele preferirse la luz artificial.
Uno de los inconvenientes de la cubeta de Copenhague habitual es la ausencia de control directo de la temperatura en el semillero. En los trópicos tiende a recalentarse (Robbins 1982b). Se han construido modelos mejorados, como el de Overaa (1962), en el que los listones son de acero inoxidable y están huecos, de manera que por ellos circula agua de calefacción o refrigeración.
Otros inconvenientes de este equipo son que exige una gran cantidad de espacio en superficie en relación con el número de ensayos que se pueden realizar, y también que manipular las cubiertas y los substratos parece más pesado que mover una ligera bandeja con substratos de papel (Justice 1972).
El aparato de Rodewald consiste en una caja de zinc con tapa de cristal en cuyo interior las semillas están expuestas a la luz directa o difusa. La base del aparato contiene agua, y encima de ésta hay una bandeja con una capa de arena húmeda. El semillero está compuesto por unos platos de porcelana sin vidriar colocados en la arena húmeda, aunque a veces se colocan directamente los platos sobre el agua. La temperatura de ésta se controla mediante un termostato, y la arena se humedece mediante unas mechas que llegan hasta el agua. El substrato de arena no está indicado en las especies que necesitan una alternancia de temperaturas, pues tarda en ajustarse a los cambios térmicos.
Armario de germinación. Otro tipo muy extendido de aparato es la cámara cerrada para germinación de semillas en condiciones de oscuridad, luz difusa o luz directa. Este tipo de germinador suele constituir en un armario de doble pared, convenientemente aislado frente a los cambios de temperatura mediante una cámara de aire o una capa de material aislante. Está dotado de unas guías adecuadas para colocar los tipos de bandejas de germinación que prefieren los distintos laboratorios. La cámara de germinación moderna está dotada de calefacción y refrigeración. Por lo general, el agua se enfría y pasa entre las paredes de la cámara o por unos conductos de refrigeración que recorren las paredes interiores. En cuanto a la calefacción, se calienta el aire o un depósito de agua situado en la base de la cámara. En estos armarios la temperatura puede regularse al nivel que se desee, entre 8°C y 40°C aproximadamente (ISTA 1976).
A veces se construyen localmente armarios de germinación baratos. Gupta y Kumar (1977) han descrito los germinadores de bajo costo que se utilizan en el laboratorio de ensayo de semillas de Dehra Dun, India. La pared exterior del armario es de teca y mide 195 × 70 × 40 cm, y los controles eléctricos comprenden un termostato, un ventilador de aire caliente, un distribuidor de aire aparte y un cronointerruptor para controlar la iluminación. Como aislamiento entre la pared interior y la exterior se utiliza fibra de vidrio. El aparato funciona satisfactoriamente a temperaturas que van desde la temperatura ambiente hasta los 45°C (± 1°C).
Los armarios de germinación deben satisfacer en la medida de lo posible los requisitos siguientes (Oomen y Koppe 1969):
humedad del aire - lo más alta posible, pero preferiblemente nunca inferior al 90 por ciento, para evitar que el substrato de las semillas se seque en exceso;
temperatura del aire - ajustable entre 10° y 35°C; en toda la sección de trabajo del armario, y a lo largo de una serie de días, la temperatura ha de ser uniforme en cada uno de los regímenes térmicos, con variaciones de más o menos 1°C;
luz - iluminación uniforme de las bandejas, con intensidad de entre 750 y 1 250 lux al nivel de las semillas;
movimiento del aire - el mínimo posible para evitar que las semillas se sequen en exceso;
suministro de aire fresco - escaso, del orden de un cambio de aire por hora, que debe ser suficiente para eliminar el dióxido de carbono que producen las semillas al germinar;
ciclo día-noche - en el cambio del día a la noche debe producirse un descenso inicial de la temperatura rápido, en 30 minutos, para después alcanzar la temperatura nocturna definitiva en 1 hora; análogos requisitos en el cambio de la noche al día;
condensación - no debe existir.
No obstante, cuando los armarios funcionan con alternancia de temperaturas es muy difícil mantener alta la humedad y secos los substratos; para ello se precisa regar con frecuencia, lo cual afecta negativamente a los resultados de la germinación y aumenta el número de horas-hombre empleadas en el ensayo (Boeke y otros 1969).
Existen muchos tipos modificados de armarios de germinación; pueden encontrarse descripciones pormenorizadas de algunos de ellos en Justice (1972) y Oomen y Koppe (1969).
Cámara de germinación. Cuando el número de ensayos es elevado pueden utilizarse para la germinación habitaciones enteras, con control de temperatura, humedad y luz.
La cámara de germinación es una modificación del armario. Su construcción obedece al mismo principio que el armario, pero es lo bastante grande para que los trabajadores puedan entrar en ella y colocar los ensayos a uno u otro lado de un pasillo central. Por lo general se precisan ventiladores para evitar que la temperatura se estratifique, y se necesita también equipo especial para mantener alta la humedad relativa.
Otra modificación es la combinación de cámara y armario de germinación. La temperatura de toda la habitación se mantiene en el nivel más bajo requerido. Dentro de esta habitación se colocan armarios de germinación, que se calientan individualmente con energía eléctrica para mantener las diversas temperaturas necesarias. Mediante este tipo de germinadoras se pueden obtener temperaturas constantes o alternas.
Cajas de germinación portátiles. Un tipo de germinador sencillo y versátil es el que consiste en una serie de cajas de plástico transparente, con tapa, que pueden apilarse una encima de otra. Robbins (1984) afirma que el recipiente ideal debe (1) ser rectangular y apilable, para ahorrar espacio; (2) ser lo bastante grande para que estén suficientemente espaciadas las semillas de una réplica como mínimo (100, 50 ó 25 semillas según el tamaño de éstas); (3) tener un fondo suficiente para que el substrato tenga la altura necesaria y para que los gérmenes se puedan desarrollar hasta permitir una evaluación adecuada; (4) tener una tapa que cierre bien, para mantener alto el contenido de humedad del substrato y el aire circundante; (5) poderse esterilizar fácilmente mediante calor o tratamiento químico, y (6) ser transparente (al menos la tapa), por si se requiere luz para la germinación y el desarrollo ulterior de los gérmenes.
En Honduras se utilizan cajas de 178 × 117 mm, con 72 mm de fondo, cada una de las cuales contiene una réplica de 100 semillas de pino. De esta manera entre cada semilla y la siguiente queda como mínimo un espacio equivalente a la anchura de una semilla. Cuando se trata de especies cuya semilla es de mayor tamaño se colocan menos semillas por caja. Puede utilizarse cualquiera de los substratos habituales que se describen infra en este mismo capítulo, como por ejemplo papel filtro o arena. Añadiendo al substrato una cantidad adecuada de agua al comienzo del ensayo y teniendo después las cajas tapadas en todo momento, salvo cuando se va a evaluar o sacar los gérmenes, se puede mantener alto y constante el contenido de humedad del substrato y del aire encerrado en las cajas, sin necesidad de añadir después más agua ni de controlar la humedad en la atmósfera que rodea las cajas. Cuando se utiliza como substrato papel filtro o papel secante, este material puede mantenerse permanentemente húmedo colocándolo en una plataforma elevada sobre un depósito de agua conectado con el substrato mediante unas mechas. Esta disposición se asemeja, en miniatura, a la del aparato de Jacobsen. Las cajas pueden colocarse en una incubadora para controlar la temperatura y la luz conforme a las recomendaciones de la ISTA por ejemplo, o, cuando no se dispone de incubadora, pueden almacenarse en condiciones de temperatua y luz ambientales. En ambos casos las semillas en germinación que se encuentran en las cajas deben disponer de las condiciones óptimas de humedad.
Investigadores del Instituto Nacional de Silvicultura de Petawawa, Canadá, han creado una caja de germinación, de plástico policarbonato ligero, irrompible y resistente al calor, que tienen la capacidad suficiente para contener cuatro réplicas de 100 semillas de pino u otras semillas de tamaño parecido (Wang y Ackerman 1983). La caja tiene 28 cm de largo por 24 cm de ancho. La base tiene 5 cm de fondo, y 1 cm la tapa, pero el especial mecanismo de cierre, de carácter universal, permite unir dos bases; combinando los elementos de esa manera se pueden montar cajas con dos fondos distintos, de 6 y 10 cm, y se utiliza un tipo u otro según las características de la especie en ensayo. El substrato de germinación está apoyado en un falso fondo perforado, sobre ocho patas de 1 cm de largo, y el espacio que queda debajo puede utilizarse en caso deseado como depósito de agua. El material plástico se puede encontrar en dos versiones, transparente o negro, para la germinación con luz o en la oscuridad respectivamente; para asegurar la oscuridad total es preciso sellar con una cinta opaca la unión entre la base y la tapa. En el tipo de plástico transparente es optativo que haya cuatro orificios de ventilación en la pared lateral del elemento inferior.
 | |
| 9.12 Cubeta de Copenhague y rollos de papel filtro para ensayos de germinación. (Centro de Semillas Forestales de DANIDA) | |
Los ensayos efectuados con esta caja de germinación han ofrecido resultados muy comparables a los obtenidos con las placas Petri, que son mucho más pequeñas y por lo tanto más incómodas. Se comprobó que al cabo de cuatro semanas la menor pérdida de humedad se había producido en las cajas que tenían el depósito de agua lleno al principio del ensayo y que no tenían orificios de ventilación. El tipo de plástico transparente y el de plástico negro resultaron a este respecto igualmente buenos, pero el desarrollo de mohos fue mayor en el tipo de plástico negro (sellado) que en el de plástico transparente. Si se colocaba sobre Kimpak (papel de celulosa) un substrato de papel secante, la pérdida de humedad era más lenta que cuando se utilizaba únicamente Kimpak.
Elección del germinador. Casi todos los laboratorios de semillas forestales que procesan una cantidad moderada de muestras utilizan germinadores del tipo armario o del tipo mesa. En un informe de Boeke y otros (1969) se recomienda a los laboratorios de ensayo de semillas pequeños que utilicen exclusivamente los germinadores de tipo armario. Los armarios tienen, sobre las mesas de germinación del tipo Copenhague las ventajas de que ahorran espacio y, cuando están bien construidos, permiten un control más preciso de la temperatura y la humedad (Oomen y Koppe 1969). Hay que señalar que un depósito de Copenhague de un solo nivel exige una cantidad de espacio en planta entre cinco y ocho veces mayor que la que ocupa un armario de igual capacidad (Boeke y otros 1969). Cuando se están investigando las condiciones de germinación, o cuando se están realizando ensayos sobre muchas semillas distintas, puede ser muy útil la flexibilidad que ofrecen varios armarios que funcionan a diferentes temperaturas y/o condiciones de luz.
En el caso de los viveros o los pequeños institutos de investigación, cuya tarea consiste en realizar sencillos ensayos de germinación sin mantener un control estricto de la temperatura y la luz, son muy recomendables, por su flexibilidad, facilidad de almacenamiento y bajo precio, las cajas de germinación de plástico. Estas pueden utilizarse asimismo en combinación con incubadoras, que poseen control de la luz y la temperatura.
Las condiciones óptimas no son las mismas en las diversas fases de la germinación y el desarrollo del germen, y puede ocurrir incluso que no sean las mismas para todas las semillas de un mismo lote. Por consiguiente, se han dedicado muchos esfuerzos de investigación en este ámbito a determinar la combinación de condiciones con la que se pueda obtener la germinación más regular, rápida y completa de la mayor parte de las semillas de una misma especie.
Substrato. La tierra se utiliza muy raramente como substrato en los ensayos de germinación, pues las muestras pueden ser muy distintas en cuanto a sus propiedades físicas, químicas y biológicas. Aunque los resultados del ensayo podrían ser más comparables si éste se realizara en las mismas condiciones en que viven las plantas en el campo, la falta de reproducibilidad y la dificultad a la hora de comparar ensayos de diferentes lotes de semilla desaconsejan la utilización de este substrato. Los materiales artificiales se prestan mucho mejor a la normalización.
En la mayoría de los ensayos de laboratorio con especies de semillas pequeñas se utiliza papel. Entre otros materiales figuran la arena, el musgo de turba granulado y la mica expandida (vermiculita y terralita). Los principales requisitos que debe reunir un substrato (Justice 1972) son los siguientes:
La elección del medio en el que se va a colocar las semillas para que germinen depende del equipo, la especie, las condiciones de trabajo y la experiencia del operario. En las Reglas de la ISTA se prescribe el material adecuado para diversos árboles forestales (véase el Cuadro 9.2, páginas 312–313).
El papel filtro, el cartón fuerte o cualquier otro papel absorbente pueden unirse a una mecha de papel filtro o algodón que está sumergida en agua por el otro extremo, o pueden colocarse encima de una capa de arena o vermiculita. El papel de celulosa se utiliza cada vez más como medio de germinación debido a que es más fácil manipular que la arena y permite igualmente que penetre en él la radícula, lo que facilita una mejor evaluación de la germinación anormal. Además, el contenido de humedad no tiende a estratificarse dentro del medio de papel, a diferencia de lo que ocurre con la arena (Belcher 1974).
Los mejores substratos de papel para la germinación son el papel secante, las toallas de papel, el papel filtro de laboratorio y el papel de celulosa plisado que se utiliza como relleno (Bonner 1974). Siempre que se utilice un substrato de papel debe comprobarse que no están presentes en él sustancias químicas tóxicas. En las Reglas de la ISTA de 1976 figuran especificaciones pormenorizadas sobre tipos de papel y toallas, incluidos aspectos como el peso, la resistencia al estallido, la ascensión capilar y la acidez.
Las semillas que no tienen una necesidad de luz específica pueden colocarse encima del papel o dentro del papel plegado. Este incrementa la superficie de contacto entre las semillas y la fuente de humedad. Las semillas grandes pueden enrollarse en toallas de papel que después se colocan en vertical; esto hace que las raíces puedan crecer hacia abajo y evita que se enreden (MacKay 1972). Estos paquetes de papel enrollado o plegado pueden mantenerse húmedos sin necesidad de una mecha sumergida en agua. Los rollos de papel con semillas pueden almacenarse en platos de vidrio colocados encima de un depósito de agua, pero no en contacto con ésta, y después se cubre el conjunto con polietileno (Knudsen 1982). Los rollos en los que se adviertan signos de desecación pueden rociarse con agua. La utilización de papel enrollado es un método muy rápido y cómodo, pero puede hacer que las radículas se encrespen. Esto no importa cuando tras el ensayo no se van a utilizar las semillas germinadas. En casos de germinación operacional de grandes cantidades de semilla, en cambio, es preferible el método de papel plegado, aunque sea algo más lento. En Tailandia se utiliza con éxito este método como práctica habitual con Pinus y Eucaliptus spp. (Sirikul 1975).
La arena no es un material adecuado cuando las semillas son muy pequeñas, pues resulta difícil encontrarlas, pero se utiliza mucho cuando las semillas son más grandes. Puede esterilizarse, y es un medio menos adecuado que el papel para el desarrollo de hongos. Proporciona asimismo un buen contacto entre la semilla y la humedad, pues las semillas pueden introducirse a presión en el medio. Una norma de sentido común consiste en cubrir la semilla con una capa de arena cuyo grosor sea como mínimo equivalente a la longitud de la semilla en su eje más largo (Aldhous 1972). La ISTA (1976) recomienda un grosor de 1–2 cm según el tamaño de la semilla y prescribe que las partículas de arena deben tener un tamaño de entre 0,05 y 0,8 mm y un pH de entre 6,0 y 7,5.
Se prefiere la arena como substrato de germinación para las especies arbóreas que tienen un período de germinación más largo, como por ejemplo Rosa spp., Pinus caribaea, P. elliottii y P. palustris, o semillas de mayor tamaño, como por ejemplo P. pinea y Quercus spp. (Magini 1962). Un medio de perlita-arena permite la lixiviación del agua, lo cual puede ser importante cuando se ensayan semillas recubiertas de un repelente (Belcher 1967), pero puede ser un inconveniente cuando las semillas que se ensayan son sensibles a la desecación.
Humedad y ventilación. Se ha sugerido que el nivel de humedad del substrato es una de las principales causas de la variación de los resultados que se obtienen en la investigación sobre semillas (Everson e Isley 1951). Las Reglas de la ISTA especifican que los substratos de arena deben humedecerse en función de sus características y del tamaño de la semilla que se va a ensayar y sugieren que para varios grupos de semillas agrícolas es adecuado un nivel de humedad del 50–60 por ciento de la capacidad de retención de agua de la arena. Los substratos de papel no deben estar tan mojados que se forme en torno a la semilla una película de agua. Cuando trabajaba con Pinus spp., Belcher (1974) llegó a la conclusión de que la mayoría de las especies presentaba una considerable tolerancia a diversos niveles de humedad, y de que las principales variaciones de la germinación se debían a la ausencia de humedad. Este autor encontró algunas especies que eran sensibles a la falta de humedad, mientras que otras lo eran a unos niveles de humedad muy altos.
A título general, el substrato debe estar en todo momento lo suficientemente húmedo como para aportar a la semilla la humedad necesaria, pero la humedad excesiva reduce la ventilación. Todos los ensayos deben examinarse a diario para comprobar que el contenido de humedad del substrato se encuentra cerca del nivel óptimo. El agua debe estar razonablemente libre de impurezas.
Control de la temperatura. En los ensayos de laboratorio la temperatura importante es la que existe al nivel de las semillas. La temperatura adecuada varía según la especie, y en las Reglas Internacionales para el Ensayo de Semillas figuran los valores indicados para muchas especies arbóreas. El Cuadro 9.2, en las páginas 312–313 es un extracto del cuadro correspondiente de la ISTA, mucho más amplio, y contiene los datos relativos a determinadas especies, con hincapié en especies tropicales y subtropicales. Además de la temperatura, se indican en él las prescripciones en materia de substratos, luz, períodos de recuento y tratamiento previo.
La temperatura es uno de los factores más decisivos de la germinación de las semillas en laboratorio y por ello debe ser objeto de comprobaciones periódicas. Cuando se precisa una alternancia de temperaturas, el ensayo se realiza por lo general a la temperatura baja durante 16 horas y a la temperatura alta durante ocho horas todos los días. En el caso de las especies arbóreas suele prescribirse una alternancia de 20°C y 30°C. Aunque las fluctuaciones naturales entre las temperaturas diurnas y las nocturnas no son tan pronunciadas en los bosques tropicales húmedos de tierras bajas como en otros tipos de bosque, la alternancia de temperaturas puede no obstante afectar a la germinación de especies tropicales. En un experimento efectuado con Terminalia ivorensis en Nigeria, con una alternancia de 34°C y 24°C se obtuvo una germinación del 93 por ciento en 41 días, frente a un 27 por ciento con una temperatura constante de 30°C, en ambos casos con luz constante (Okoro 1976).
Luz. Las semillas de muchas especies arbóreas necesitan luz para germinar. La luz fluorescente es tan eficaz como la luz diurna natural, y se prefiere en los ensayos debido a que, dentro de unos límites, pueden normalizarse la longitud de onda y la intensidad. Se recomiendan, por la calidad de su luz y el poco calor que emiten, las lámparas fluorescentes de luz blanca y fría. La luz debe estar distribuida, de manera uniforme por toda la superficie del ensayo, y su intensidad debe oscilar entre 750 y 1 250 lux. Las semillas deben tener luz únicamente durante una parte del período de ensayo, por lo general 8 horas de cada 24, pero en el caso de las semillas de algunas especies puede ser conveniente alargar o acortar ese tiempo.
Lucha contra los hongos en los ensayos de germinación. Entre las prácticas de laboratorio que están encaminadas a reducir el mínimo la difusión de hongos figuran las consistentes en colocar las semillas en el espaciamiento adecuado, controlar la temperatura, retirar las semillas podridas, ventilar adecuadamente y mantener el substrato con un nivel de humedad que no sobrepase el necesario para que se produzca la germinación. También es útil esterilizar el equipo de laboratorio y desinfectar periódicamente los armarios de germinación y otros aparatos. Como norma general, la semilla no se desinfecta, pues las semillas que presentan podredumbre suelen ser de escasa calidad. Magini (1962) afirma que en diversos experimentos efectuados con distintos métodos de desinfección de la semilla un poco antes de la germinación o durante ella no se obtuvo una mejora fiable del porcentaje de germinación. Al ensayar semillas de coníferas en Dinamarca se comprobó, en cambio, que era beneficioso añadir una pequeña cantidad de fungicida al agua que se utiliza para humedecer los rollos de papel (Knudsen 1982). En Australia, al ensayar las semillas de eucalipto en papel de filtro humedecido sobre una capa de vermiculita, resultó también eficaz rociar con fungicida Karathane a una concentración de 0,8 g en un litro de agua destilada (Boland y otros 1980).
Las condiciones que prescriben la CSIRO y la ISTA para los ensayos de germinación de determinadas especies tropicales, subtropicales y de la zona templada figuran en los Cuadros 9.1, página 311, y 9.2, páginas 312–313 respectivamente.
Notas al Cuadro 9.1:
Cuando las recomendaciones de temperatura están separadas por punto y coma, es que se ha comprobado que esas temperaturas (constantes) son satisfactorias. No es necesaria la alternancia de temperaturas.
A menos que se especifique otra cosa, el substrato utilizado normalmente en los ensayos con eucaliptos en la División de Investigaciones Forestales, CSIRO, Canberra, es papel filtro humedecido sobre vermiculita en una placa Petri. Cuando se recomienda “sólo vermiculita” debe omitirse el papel filtro.
Cuando una temperatura figura entre paréntesis, por ejemplo (25), es que se han obtenido resultados satisfactorios con esa temperatura pero no se han realizado ensayos con una serie completa de otras posibilidades.
Cuadro 9.1
Datos sobre viabilidad de las semillas y recomendaciones para el ensayo de determinados eucaliptos
(extraído, con actualizaciones, de Boland y otros 1980)
| Especie | Recomendaciones para el ensayo de semillas | |||||
| No. medio de semillas viables por gramo de semilla y granzas | Peso de la réplica (g) | Temperatura (°C) 1) | Primer recuento (días) | Recuento final (días) | Recomendaciones especiales 2) | |
| E. brassiana | 340 | 0,15 | 25 | 7 | 14 | |
| E. camaldulensis | 670 | 0,10 | 30 | 5 | 10 | Esencial la luz |
| E. citriodora | 110 | 0.50 | 25;30 | 5 | 14 | Sólo vermiculita |
| E. cloeziana | 130 | 0,40 | 25 | 7 | 28 | Sólo vermiculita |
| E. deglupta | 4,000 | 0,01 | 35 | 5 | 14 | Sólo vermiculita |
| E. globulus subsp. globulus | 75 | 0,70 | 25 | 5 | 14 | |
| E. grandis | 650 | 0,10 | 25 | 5 | 14 | |
| E. microtheca | 380 | 0,15 | 35 | 3 | 14 | Esencial la luz, sólo vermiculita o estratificar 3 semanas, después 20°C |
| E. regnans | 180 | 0,30 | 15 | 10 | 21 | |
| E. saligna | 540 | 0,10 | 25 | 5 | 14 | |
| E. tereticornis | 600 | 0,10 | 25;30;35 | 5 | 14 | |
| E. urophylla | 460 | 0,10 | (25) 3) | 5 | 14 | |
Cuadro 9.2
Tomado de ISTA (1976), Cuadro 5A. Métodos de germinación. Parte II, Semillas de Arboles. (Comprende las modificaciones introducidas en ISTA 1978).
En este cuadro figuran los substratos, temperaturas y períodos de tiempo que se pueden utilizar, así como otras recomendaciones, como por ejemplo tratamientos especiales para muestras durmientes. En el caso de las especies de la sección 1, los métodos de las columnas 2–6 son prescriptivos, y no pueden utilizarse otros.
Cuando en la columna de temperatura aparecen dos cifras, por ejemplo 20–30, se trata de la alternancia diaria de esas temperaturas. La inferior debe mantenerse durante 16 horas de cada 24, y la superior durante las 8 horas restantes.
Con las especies de la sección 2 pueden utilizarse otros métodos siempre que el método elegido se indique en el Certificado Internacional de Análisis.
En el caso de algunas especies, y como se indica en la columna 7, se precisa un doble ensayo (con y sin enfriamiento previo); la fase de germinación debe ser simultánea en ambos.
Los métodos menos aconsejables figuran en el cuadro entre paréntesis.
Las abreviaturas tienen los significados siguientes:
| PSP | - | parte superior de papel |
| EP | - | entre papeles (incluidos rollos y papel plisado) |
| A | - | arena |
| PSA | - | parte superior de arena |
| L | - | esencial la luz |
| TT | - | ensayo topográfico con tetrazolio |
| 1) | - | en 1981, mediante una modificación de la ISTA, se suprimió la referencia a réplicas pesadas en Eucaliptus y otros géneros. En el Apéndice 3 de Boland y otros 1980 figuran unas orientaciones sencillas y actualizadas para el ensayo de eucaliptos. En el Cuadro 9.1 se reproducen datos tomados de ese apéndice y correspondientes a algunas de las especies más importantes. |
| Especie | Prescripciones en materia de: | Otras instrucciones, incluidas recomendaciones para romper la latencia | |||||
| Substrato | Temperatura (°C) | Luz | Primer recuento (días) | Recuento final (días) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| SECCION 1 (Prescriptiva) | |||||||
| Acacia spp. | PSP | 20–30(20) | L | 7 | 21 | 1) | Perforar la semilla, cortar o raspar un fragmento de la testa en el extremo de los cotiledones y remojar durante tres horas, o |
| 2) | (Remojar las semillas durante una hora en H2SO4 concentrado, lavarlas bien en agua corriente tras el tratamiento con ácido). | ||||||
| Ailanthus altissima | PSP | 20–30 | - | 7 | 21 | Quitando el pericarpo tras 24 horas de remojo se puede acelerar la germinación. | |
| 1) Alnus spp. | PSP | 20–30 | L | 7 | 21 | (Puede ensayarse también mediante cuatro réplicas pesadas de entre 0,10 y 0,25 g cada una, según la especie). | |
| Cedrela spp. | PSP | 20–30 | L | 7 | 28 | ||
| Cryptomeria japonica | PSP | 20–30 | L | 7 | 28 | ||
| Cupressus sempervirens | PSP | 20 | L | 7 | 28 | ||
| 1) Eucalyptus camaldulensis | PSP | 30 | L | 3 | 14 | Utilizar cuatro réplicas pesadas de 0,10 gramos cada una. | |
| Liquidambar styraciflua | PSP | 20–30 | L | 7 | 21 | Sensible a la desecación durante el ensayo. | |
| Nothofagus obliqua | PSP | 20–30 | L | 7 | 28 | Sin enfriamiento y con enfriamiento previo durante 28 días a 3–5°C. Ensayos dobles. | |
| Pinus caribaea | PSP | 20–30 | L | 7 | 21 | ||
| P. elliottii | PSP | 22;20–30 | L | 7 | 28 | ||
| P. pinaster | PSP | 20 | - | 7 | 35 | 1) | Sin enfriamiento previo y con enfriamiento previo durante 28 días a 3–5°C. Luz durante no más de 16 horas al día. Ensayos dobles. |
| 2) | (Utilizar TT). | ||||||
| P. radiata | PSP | 20 | L | 7 | 28 | ||
| P. taeda | PSP | 20;20–30 | 7 | 28 | |||
| Quercus spp. | PSA(A) | 20 | 7 | 28 | Remojar las semillas durante un período de hasta 48 horas, cortar ⅓ en el extremo de la cicatriz de la semilla y quitar la testa. | ||
| Robinia pseudoacacia | PSP | 20–30 | 7 | 14 | 1) | Perforar la semilla o cortar o raspar un fragmento de la testa en el extremo de los cotiledones y remojar durante tres horas. | |
| 2) | (Remojar las semillas enteras durante una hora en H2SO4 concentrado, durante el tiempo necesario para que se “pique” la superficie de la testa. Lavar las semillas a fondo en agua corriente). | ||||||
| SECCION 2 (No Prescriptiva) | |||||||
| Pinus kesiya | PSP | 20–30 | L | 7 | 21 | ||
| P. merkusii | PSP | 20–30 | L | 7 | 21 | ||
| P. oocarpa | PSP | 20–30 | L | 7 | 21 | ||
| P. patula | PSP | 20(20–30) | L | 7 | 21 | ||
| Tectona grandis | A | 30 | L | 14 | 28 | Remojar en agua y dejar secar durante tres días - repetir la operación seis veces. | |
Se considera que una semilla ha germinado cuando han surgido de su embrión, y se han desarrollado a partir de él, las estructuras esenciales que indican la capacidad de la semilla para producir una plántula normal en condiciones favorables. En el recuento de germinación no se incluye a los gérmenes anormales, pues éstos raras veces sobreviven para producir plantas. En las Reglas de la ISTA (ISTA 1976) se identifican cuatro grupos de gérmenes anormales: (a) gérmenes dañados, (b) gérmenes deformados, (c) gérmenes podridos, y (d) gérmenes con un desarrollo inusual del hipocótilo. En las Reglas de la ISTA se definen en detalle estos grupos y sus características. En un ensayo de laboratorio lo normal es que se saque la mayor parte de los gérmenes normales en los recuentos intermedios, pero la valoración de muchos de los gérmenes dudosos y anormales ha de dejarse hasta el final del ensayo, de manera que no se clasifiquen erróneamente como anormales los gérmenes que son de crecimiento más lento pero no presentan anormalidad alguna.
En muchas especies el recuento inicial se efectúa a la semana de iniciarse el ensayo, y pueden realizarse evaluaciones semanales hasta que termina el ensayo. Cuando se desea obtener una idea más exacta de la velocidad de germinación, la frecuencia de las evaluaciones habrá de ser mayor. Al término del período del ensayo deben cortarse y examinarse todas las semillas que hayan quedado sin germinar, y debe registrarse el número de semillas frescas, firmes y posiblemente viables (Bonner 1974). Al mismo tiempo pueden efectuarse observaciones sobre el estado de las semillas no germinadas y no viables, como por ejemplo una incidencia inusualmente alta de semillas dañadas por insectos o mecánicamente, lo cual indicaría la necesidad de mejorar la higiene de la semilla o los métodos de procesamiento de ésta. El resultado de un ensayo de germinación suele indicar por separado el porcentaje de semillas germinadas y el de semillas no germinadas pero aparentemente viables, por ejemplo en el caso siguiente:
| Porcentaje de germinación | = | 82% |
| Porcentaje de semillas no germinadas pero viables | = | 6% |
| Porcentaje de viabilidad | = | 82% + 6% (= 88%) |
9.13 Bellotas de Quercus alba germinando en Kimpak, en los Estados Unidos. Adviértase el espaciamiento entre las semillas.
(Servicio Forestal, Dpto. Agric. EE.UU.)
En los Cuadros 9.1 y 9.2 puede observarse que lo habitual es que los ensayos duren entre dos y cinco semanas, pero en este tiempo no está incluido el posible período de tratamiento previo para romper la latencia (véase el Capítulo 8). Son muchas las especies que no necesitan un tratamiento previo, y algunos tipos de latencia de la cubierta seminal pueden tratarse satisfactoriamente en cuestión de horas. El tratamiento previo que se prescribe para Tectona, en cambio, dura 18 días, y en algunos casos el enfriamiento previo que está prescrito debe prolongarse durante 3–9 meses. Al planificar un programa de ensayos es necesario tener en cuenta no sólo el tiempo del ensayo propiamente dicho, sino también el del tratamiento previo. En casos extremos puede ser necesario sustituir el ensayo de germinación por uno de los ensayos indirectos de viabilidad que se describen infra.
Hay más de una forma de definir la energía de germinación (Ford - Robertson 1971): (1) el porcentaje, en número, de semillas de una muestra determinada que germinan dentro de un período determinado (que se denomina el período de energía), por ejemplo en 7 ó 14 días, en óptimas o determinadas condiciones, y (2) el porcentaje, en número, de semillas de una muestra determinada que germinan hasta llegar al momento de germinación máxima, que generalmente significa el número máximo de germinaciones en 24 horas.
En ambas definiciones la duración del período de energía es considerablemente inferior a la del período del ensayo completo que prescribe la ISTA. La energía germinativa es una medida de la velocidad de la germinación, y por ello se supone que también lo es del vigor de la semilla y del germen que produce. El interés por la energía germinativa se basa en la teoría de que probablemente sólo las semillas que germinan con rapidez y vigor en las condiciones favorables del laboratorio serán capaces de producir plántulas vigorosas en las condiciones que existen sobre el terreno, donde una germinación débil o retrasada suele tener consecuencias fatales (Aldhous 1972). Se han publicado pocos datos experimentales que avalen esta teoría, pero los germinantes que presenten un retraso excesivo deben eliminarse automáticamente del vivero, bien porque sucumben ante competidores más antiguos y más vigorosos, bien porque, si ya se ha terminado el trasplante, no justifican el esfuerzo de un trasplante especial suplementario. En las páginas 342–343 se ofrece un ejemplo de la forma de calcular la energía de germinación.
Otro método para comparar la energía de germinación de diferentes lotes de semilla consiste en registrar la “tasa de germinación”, es decir, el número de días que se necesitan para conseguir el 50 por ciento de la capacidad de germinación (Allen 1958). Cuanto más breve sea ese período, tanto mayor será la energía de germinación. Existe todavía otro método, consistente en evaluar la fase de desarrollo en que se encuentran las semillas germinadas y clasificar éstas en una serie de clases en función del desarrollo o vigor. Por ejemplo, Wang (1976) utilizó siete clases para las semillas germinadas normales de Picea glauca, además de las semillas no germinadas y las germinadas de manera anormal; esas clases iban desde gérmenes con raíz sana, hipocótilo plenamente desarrollado y caída total de la cubierta seminal hasta que las semillas en las que la cubierta ya se había abierto pero aún no había surgido la radícula.
El concepto de valor de germinación, tal como lo define Czabator (1962), tiene por finalidad combinar en una sola cifra una expresión de la germinación total al término del período de ensayo y una expresión de la energía o velocidad de germinación. La germinación total se expresa en forma de germinación diaria media (GDM) (final), que se calcula como el porcentaje acumulado de semillas llenas germinadas al final del ensayo dividido por el número de días que transcurren desde la siembra hasta el término del ensayo. La velocidad de germinación se expresa en forma de valor máximo (VM), que es la germinación diaria media máxima (porcentaje acumulado de germinación de semilla llena dividido por el número de días transcurridos desde la fecha de siembra) que se alcanza en cualquier momento del período del ensayo. El valor de germinación (VG) puede por tanto calcularse mediante la fórmula siguiente:
VG = GDM (final) × VM
El valor de germinación se ha utilizado, en tanto que medida integrada de la calidad de la semilla, en varios trabajos sobre semillas tropicales, por ejemplo con Terminalia ivorensis (Okoro 1976) y Pinus kesiya (Costales y Veracion 1978).
Otro método para calcular el valor de germinación es el que han propuesto Djavanshir y Pourbeik (1976), quienes comprobaron que, en el caso de Pinus ponderosa y P. eldarica en el Irán, se ajustaba más que el método de Czabator a la supervivencia de las plantas en viveros sobre el terreno. La fórmula propuesta por estos autores es la siguiente:
donde:
| VG | = | Valor de la germinación |
| PG | = | Porcentaje de germinación al final del ensayo |
| VGD | = | Velocidad de germinación diaria, que se obtiene dividiendo el porcentaje de germinación acumulado por el número de días transcurridos desde la siembra |
| ΣVGD | = | Total que se obtienen sumando todas las cifras de VGD obtenidas en los recuentos diarios |
| N | = | Número de recuentos diarios, empezando a contar a partir de la fecha de la primera germinación |
Los cálculos que se requieren son algo más largos que los del método de Czabator, y, en el caso de muchas modalidades de germinación, es probable que el método más sencillo permita establecer comparaciones entre lotes suficientemente exactas. En las páginas 344–345 se ofrecen ejemplos de cálculo del VG con uno y otro método.
Un buen ejemplo de método adecuado para realizar ensayos de germinación en el vivero es el procedimiento que se ha recomendado para los pinos tropicales de Malasia occidental (Paul 1972):
“Tomar 400 semillas puras y dividirlas en cuatro muestras, cada una de 100 semillas. Tomar cuatro cajas de madera o plástico (son muy aconsejables las cajas de varias capas de plástico flexible opaco) de 30 × 30 cm y unos 10 cm de fondo y llenarlas al máximo, casi un poco en exceso, de arena cernida, hasta llegar al límite superior de las paredes. Mojar la arena poniendo en cada caja medio litro de agua. Nivelar la arena enrasándola con la parte superior de la caja y hacer a intervalos de 2,5 cm unos orificios de 6 mm de profundidad (en el caso de P. oocarpa los orificios deben tener sólo 3 mm de profundidad). Sembrar las semillas (100) a intervalos de 2,5 cm y, presionando suavemente, introducirlas en los orificios abiertos en la arena. Cubrir con una capa de 6 mm (3 mm en P. oocarpa) de arena que pase por un tamiz del No 12 (4,76 mm de malla) pero no por uno del No 8 (3, 18 mm). Mojar ligeramente con un nebulizador fino. Tapar con polietileno transparente de 0,2 mm de grosor montado sobre la parte superior de un bastidor de madera cuadrado, perfectamente ajustado, de 5 cm de grosor. A las 24 horas se apreciará condensación por la parte interior de la tapa de polietileno. Si durante los siete días siguientes se observa en algún momento que ha desaparecido la humedad, rociar ligeramente con un nebulizador y volver a tapar. Lo normal es que la germinación se inicie el séptimo día, momento en el que se puede quitar la tapa. Mantener la arena húmeda. Se considera que una semilla ha germinado cuando ha alcanzado una altura de 1 cm en total, con la cubierta que recubre los cotiledones. Llevar un registro distinto para cada una de las cuatro cajas y consignar en él toda la germinación que se produce entre el séptimo y el vigésimo octavo día. Sacar los gérmenes nada más registrarlos, y sacar también todos los gérmenes enfermos, aunque no hayan alcanzado la altura de 1 cm, para evitar que infecten a otros.
En el vigésimo octavo día después de la siembra, cribar la capa superior de arena de cada caja por un tamiz del No 12 (4,76 mm de malla) y registrar el número de semillas completas que no han germinado. (Utilizar para ello el ensayo de corte).”
Mediante la utilización de cuatro réplicas en el ensayo de germinación se puede medir el grado de variación que existe en la muestra. Un método sencillo consiste en calcular el intervalo de diferencia de porcentaje de germinación que existe entre la submuestra más alta y la más baja. Este intervalo puede compararse después con el cuadro que ha publicado la ISTA (1976) y que se reproduce aquí como Cuadro 9.3, página 321 (es aplicable a réplicas de igual número de semillas, no de igual peso). Siempre que el intervalo efectivo sea inferior al intervalo máximo que figura en el cuadro, la muestra podrá considerarse homogénea, y aceptarse el promedio de las cuatro réplicas. Si el intervalo efectivo es superior al máximo del cuadro, entonces debe tomarse una nueva muestra para repetir el ensayo. Son causas frecuentes de esas situaciones la falta de homogeneidad en la semilla y, en los ensayos que se realizan en el vivero, el daño por hongos e insectos en una o varias réplicas (Paul 1972). También es necesario repetir el ensayo cuando al término de éste queda un porcentaje sumamente alto de semillas llenas pero no germinadas (Bonner 1974). En ese caso, la repetición del ensayo debe efectuarse con un tratamiento previo distinto, para tratar de romper la latencia y mejorar la germinación total.
Cuadro 9.3
Intervalos máximos tolerados entre réplicas
(tomado del Cuadro 5 B, ISTA 1976)
En este cuadro se indica el intervalo máximo (es decir, la diferencia máxima entre el valor más alto y el más bajo) de porcentaje de germinación que es tolerable entre réplicas, lo que permite una variación de muestreo aleatorio solamente con una probabilidad de 0,025. Para hallar el máximo intervalo tolerado en un caso determinado, hay que calcular el porcentaje medio, redondeado al número entero más próximo, de las cuatro réplicas: en caso necesario, se formarán réplicas de 100 semillas combinando las subréplicas de 50 ó 25 semillas que estaban más próximas en el germinador. Después se localiza el promedio en la columna 1 ó 2 del cuadro y se lee el intervalo máximo tolerado correspondiente en la columna 3.
| Porcentaje de germinación medio | Intervalo máximo | |
| 1 | 2 | 3 |
| 99 | 2 | 5 |
| 98 | 3 | 6 |
| 97 | 4 | 7 |
| 96 | 5 | 8 |
| 95 | 6 | 9 |
| 93 a 94 | 7 a 8 | 10 |
| 91 a 92 | 9 a 10 | 11 |
| 89 a 90 | 11 a 12 | 12 |
| 87 a 88 | 13 a 14 | 13 |
| 84 a 86 | 15 a 17 | 14 |
| 81 a 83 | 18 a 20 | 15 |
| 78 a 80 | 21 a 23 | 16 |
| 73 a 77 | 24 a 28 | 17 |
| 67 a 72 | 29 a 34 | 18 |
| 56 a 66 | 35 a 45 | 19 |
| 51 a 55 | 46 a 50 | 20 |
En los lotes comerciales de semilla de Eucalyptus no suele efectuarse el ensayo de pureza, pues es difícil o imposible separar la semilla de las granzas de algunas especies (Boland y otros 1980). Entre las especies en las que las semillas y las granzas son muy parecidas de tamaño, peso y color figuran E. cloeziana, E. regnans y E. delegatensis. Otros géneros de semillas pequeñas en los que resulta difícil separar la semilla pura son Alnus, Betula, Populus y Salix. Y cuando es posible, la separación es muy laboriosa en estas especies. En el laboratorio de semillas de Canberra se tarda sólo 6–7 minutos en preparar un ensayo de semillas de eucalipto con cuatro réplicas pesadas, mientras que en separar las semillas para efectuar un ensayo de pureza y en montar éste con cuatro muestras de 100 semillas cada una se tarda entre 20 y 50 minutos, según el grado de dificultad que tenga la eliminación de las granzas (Turnbull 1983). El pequeño tamaño de las semillas impide asimismo realizar un ensayo de corte para determinar el número de semillas llenas pero no germinadas al término del ensayo. Por esas razones, lo mejor es realizar los ensayos sobre réplicas en peso y registrar los resultados como número de semillas germinadas por unidad de peso de la mezcla impura de semilla y material inerte. También se puede efectuar un ensayo de aplastamiento para obtener una estimación aproximada de la viabilidad.
Cuando la semilla se siembra al voleo, al ingeniero forestal que ejerce en la práctica le interesa sobre todo el número de plantas que puede esperar obtener de una determinada parte, en peso, del lote de semilla que recibe. Siempre que se le diga que un kilogramo de semilla “impura” producirá 36 000 plántulas germinadas, le da igual que ese resultado se deba a una combinación de 90 por ciento de pureza por 80 por ciento de germinación de semilla pura o de 80 por ciento de pureza por 90 por ciento de germinación de semilla pura. En los ensayos locales, por consiguiente, y cuando el laboratorio de semillas no tiene personal suficiente, no hay objeción a que se omita el ensayo de pureza incluso en las especies en las que sería factible efectuarlo. En el caso de la siembra directa en recipientes individuales, en cambio, son evidentes las ventajas de obtener cifras por separado sobre la pureza y la germinación, pues la siembra se efectúa sobre la base de un determinado número de semillas (de una a varias) por recipiente, y no de peso de semilla por metro cuadrado de semillero o bandeja.
Para estimar el potencial de germinación de un lote de semilla, el método más indicado en la silvicultura práctica suele ser el que consiste en germinar efectivamente una muestra de ese lote. Pero se tarda varias semanas en completar estos ensayos, a lo que hay que añadir en algunas especies algunas semanas más, o meses, de tratamiento previo. Este es el motivo de que se haya investigado ampliamente la posibilidad de otros métodos mediante los cuales se pueda estimar la viabilidad de la semilla con precisión y a la vez en mucho menos tiempo que el que precisan los ensayos de germinación. La descripción de esos métodos que figura a continuación está fielmente basada en la de Turnbull (1975d).
Los ensayos rápidos de viabilidad persiguen los dos objetivos siguientes:
determinar rápidamente la viabilidad de semillas de especies que normalmente germinan con lentitud o muestran latencia cuando se le aplican los métodos de germinación normales.
determinar la viabilidad de muestras que al término del ensayo de germinación presentan un elevado porcentaje de semillas frescas pero no germinadas o duras.
Hasta hace poco tiempo, la Asociación Internacional de Ensayo de Semillas solamente aceptaba dos métodos, el ensayo topográfico de tetrazolio y el ensayo de excisión del embrión, como métodos oficiales para algunos tipos de semillas. Recientemente la ISTA ha aceptado el método de rayos X como alternativa válida al ensayo de corte para detectar las semillas vacías y dañadas por insectos. Según las circunstancias, puede aplicarse cualquiera de los ensayos que se describen a continuación:
El método más sencillo para determinar la viabilidad es la inspección visual directa de las semillas, previamente abiertas con un cuchillo o escalpelo. Si el endosperma tiene un color normal y el embrión está bien desarrollado, la semilla tiene muchas posibilidades de germinar. Este ensayo no es muy fiable. No es difícil considerar como no viables las semillas que tienen el embrión lechoso, poco firme, mohoso, podrido, consumido o con olor rancio y las semillas abortivas que carecen de embrión (Bonner 1974). Pero no es posible distinguir las semillas moribundas, recién muertas o recién dañadas que siguen teniendo el mismo aspecto que las semillas viables. Como ya se ha señalado, el ensayo de corte se utiliza al término de un ensayo de germinación para determinar la viabilidad aparente de las semillas que no han germinado; es también un instrumento útil para estimar el tamaño y la madurez de la producción de semilla antes de la recolección (Capítulo 3), así como la eficiencia de los métodos de procesamiento.
En Filipinas se ha comprobado que existe una buena correlación entre el ensayo de corte y el de germinación en especies de semilla bastante grande, como Leucaena, Intsia bijuga y Lagerstroemia speciosa (Seeber y Agpaoa 1976), aunque el porcentaje de germinación era sistemáticamente un 10–20 por ciento inferior al porcentaje de semillas viables que arrojaba el ensayo de corte.
El método de tetrazolio es uno más de los varios ejemplos de ensayo bioquímico de semillas que se han ideado. En Moore (1969) figura un breve examen de esos diversos tipos de ensayo. El de tetrazolio lo introdujo G. Lakon en 1942 en Alemania.
En este método se tiñen de rojo las células vivas mediante la reducción de una sal de tetrazolio, que es incolora, para formar un formazano rojo. Se hace hincapié en la necesidad de conocer la viabilidad de las distintas partes del embrión para predecir el desarrollo de embriones y su conversión en gérmenes que se puedan contar (Moore 1973).
El procedimiento del ensayo se describe pormenorizadamente en las Reglas de la ISTA (ISTA 1976), que aprueban el ensayo en algunas especies de frondosas y coníferas que germinan con lentitud cuando se les aplican los métodos habituales. La práctica normal consiste en poner las semillas en remojo en agua durante unas 20 horas, después cortar o perforar la cubierta seminal para facilitar la entrada de la solución acuosa de tetrazolio (TZ), al 1 por ciento, y después dejar las semillas en ese líquido, en un lugar oscuro, durante 48 horas (Bonner 1974). El proceso puede acelerarse considerablemente cortando por completo la semilla a una distancia de un tercio del micrópilo y colocándola durante sólo media hora en una máquina de vacío tipo Vitascope. Aunque este método dio resultados satisfactorios en Dinamarca, para interpretar los resultados es preciso que el operario tenga más experiencia que en el método de inmersión de la semilla y excisión del embrión teñido (Knudsen 1982). El ensayo se efectúa sobre cuatro réplicas de 100 semillas cada una (ISTA 1976).
Justice (1972) señala que, aunque el procedimiento del tetrazolio es bueno en principio, su utilización práctica en los ensayos rutinarios se ve limitada por numerosos problemas, entre ellos los siguientes: la resistencia a teñirse que presentan algunas semillas; la necesidad de cortar o diseccionar las semillas para poder observar las partes teñidas; la escasa coincidencia con los resultados de los ensayos de germinación en algunos casos, especialmente en las semillas que tienen una capacidad germinativa baja; la ausencia de una interpretación uniforme del teñido y la dificultad de interpretar la significación de los diferentes grados del mismo, y un mayor número de horas-hombre para ensayar 400 semillas en comparación con los ensayos de germinación ordinarios.
Moore (1973) admite que para que este “ensayo de sentido común” funcione perfectamente es necesario contar con un analista experimentado. Es indudable que puede ser útil para determinar la viabilidad de algunas especies, siempre que se disponga de personal capacitado para preparar las semillas y evaluar los resultados.
Este método consiste en dejar las semillas en remojo durante 1–4 días y después excindir los embriones de las semillas y colocarlos en papel filtro o discos secantes humedecidos en placas Petri. Se colocan después a la luz, con una temperatura constante de 20°C. Todos los días se examina el estado de los embriones. Según la especie y el lote de que se trate, el ensayo puede concluir en unos pocos días, prolongarse hasta un máximo de 14 días o mantenerse hasta que es posible diferenciar claramente los embriones viables de los no viables.
El ensayo de excisión del embrión se asemeja a los ensayos de germinación en que se basa en la germinación real de la semilla para medir su calidad. Además, permite efectuar también una medición de la latencia del embrión, pues se cuentan las semillas que, aunque sin crecer normalmente, se han desarrollado algo, se han mantenido firmes y han conservado su color durante el período del ensayo. Este no es válido para las semillas germinadas secas. Para que el ensayo se realice satisfactoriamente es neceario que el operario posea un nivel considerable de aptitud y experiencia, y además las Reglas de la ISTA lo limitan únicamente a unas cuantas especies.
En un estudio completo, Schubert (1965) comparó el método de excisión del embrión con el de tetrazolio para determinar la viabilidad de las semillas de árboles que presentan latencia. Llegó a la conclusión de que debe preferirse el método de tetrazolio al de excisión del embrión, pero que debe mejorarse el primero incorporando la utilización de bactericidas y aplicando soluciones reductoras más fuertes para resolver las dudas que plantean los tejidos débilmente teñidos.
Hace más de 70 años que se utilizaron por vez primera las radiografías para determinar la calidad de las semillas (Lundstrom, 1903, citado por Kamra 1964). Los estudios de Simak y Gustafsson (1953) destacaron la importancia de la técnica de rayos X como método de diagnóstico en el análisis de las semillas arbóreas. Se desarrolló así el método de contraste con rayos X, que utiliza diversos agentes de contraste o radiopacos y que se ha aplicado con éxito a especies de Pinus y Picea (Simak 1957; Kamra 1963a, b).
El método de rayos X permite detectar las semillas vacías y las estructuras seminales que presentan daño mecánico o un desarrollo interno anormal, medir el grosor de la cubierta y evaluar la viabilidad de la semilla cuando se combina con un agente de contraste.
El método de contraste con rayos X se basa en el principio de semipermeabilidad. Cuando se tratan las semillas con un agente de contraste, por ejemplo BaCl2 acuoso o CHCl3 en forma de vapor, sus tejidos vivos son capaces de evitar la entrada de este agente debido a su semipermeabilidad, mientras que los tejidos muertos se impregnan de él. Los tejidos impregnados absorben los rayos X de una manera más intensa que los no impregnados, y por lo tanto aparecen en la película con un color más claro que éstos. El contraste permite localizar en la semilla los tejidos que están vivos y los que están muertos, así como estimar su viabilidad (Kamra 1964). En la actualidad ya es posible utilizar, como agente de contraste para determinar la viabilidad de la semilla, agua no tóxica en vez de BaCl2 o CHCl3, que son tóxicos (Simak 1982).
La aparición de equipo de rayos X blandos ha simplificado considerablemente la operación (Belcher 1973). No se precisa equipo fotográfico complicado, y puede utilizarse película polaroid, con la que se obtienen radiografías claras y detalladas en 30 segundos (Edwards 1973).
La radiografía de rayos X se ha aplicado con éxito a la determinación del número de semillas en los frutos de teka (Tectona grandis) y al estudio de sus fases de desarrollo (Kamra 1973). Esta técnica se ha ensayado en los frutos o semillas de 60 especies arbóreas tropicales, y los resultados indican que puede aplicarse con fiabilidad en su procesamiento (Kamra 1974, 1976, 1980).
Kamra, Meyer y Wegelius (1973) han desarrollado una técnica de estereorradiografía que complementa el método de contraste con rayos X como procedimiento para determinar la calidad de las semillas. La principal ventaja de la estereorradiografía es que el observador puede obtener una visión tridimensional del objeto a partir de dos radiografías. De esta manera puede determinarse con fiabilidad la ubicación topográfica exacta del agente de contraste en la semilla. Con ello se amplía la información que puede obtenerse de las radiografías y se aumenta la precisión analítica.
El método de rayos X es un método útil, y es probable que desempeñe un papel cada vez más importante en el ensayo de semillas. Los primeros modelos de aparatos de rayos X eran costosos, pero los modelos recientes, especialmente los japoneses, son mucho más baratos, y en la actualidad su costo es inferior al de una germinadora de armario. Las mejoras introducidas en la película y el papel fotográficos han acelerado el proceso y simplificado la interpretación, de manera que es fácil capacitar a técnicos en la obtención de resultados congruentes. La ISTA ha aceptado el método como alternativa válida al ensayo de corte para detectar las semillas vacías y dañadas por insectos. Ha ofrecido también resultados muy prometedores como medio de distinguir, entre las “semillas llenas”, las que son viables de las que no lo son (Simak 1980, Simak y Sahlén 1981). En el caso de algunas coníferas de la zona templada se ha podido obtener una buena correlación entre la clase de desarrollo (CD) de las semillas, sobre la base del desarrollo tanto del embrión como del endosperma y su germinabilidad. En la Figura 9.16 se indican las CD que se han determinado para las coníferas, y en el Cuadro 9.4 figura la germinabilidad correspondiente a cada clase respecto de Pinus sylvestris y Picea abies (Simak 1980).
9.15 Radiografía con rayos X de frutos de teca, en los que se observa una variación en el número de lóculos (de dos a seis). (S.K. Kamra)
9.16 Radiografías con rayos X que muestran distintas clases de embrión y endosperma en las semillas de coníferas. (M. Simak)
| O | Ni embrión ni endosperma (= semilla vacía). |
| I | Endosperma y cavidad embrionaria desarrollados, pero sin que se observe embrión. |
| IIP | Endosperma y uno o más embriones pequeños cuya longitud no supera su anchura (“embriones puntuales”). |
| II | Endosperma y uno o varios embriones, ninguno de los cuales es más largo que la mitad de la cavidad embrionaria. |
| III | Endosperma y uno o más embriones, el más largo de los cuales mide entre la mitad y tres cuartas partes de la cavidad embrionaria. |
| IV | Endosperma con un solo embrión plenamente desarrollado, que ocupa por completo o casi por completo la cavidad embrionaria. En raras ocasiones aparecen embriones diminutos. |
| A | El endosperma llena casi por completo la capacidad de la cubierta seminal y absorbe fácilmente los rayos X. |
| B | El endosperma llena la cubierta seminal de manera incompleta, y suele presentar encogimiento u otra deformación. La absorción de rayos X es inferior a la del tipo A. |
| Ab | Semilla con desarrollo anormal del endosperma o el embrión. |
| J | Semillas dañadas por insectos, con larvas (JI) o excremento de éstas (Je). |
Cuadro 9.4
Germinabilidad, en porcentaje y determinada por el método radiográfico, de semillas recién recolectadas y sin daño pertenecientes a diversas CD
(Material: muestras de semilla con amplia distribución por toda Suecia. Ensayo de germinación: aparato de Jacobsen, temperatura de 23°C constantes, luz de 1 000 lux 8 horas diarias).
| Especie | CD | |||||||
| I A | II A | III A | IV A | II P | II B | III B | IV B | |
| Pinus sylvestris | 0 | 50 | 88 | 99 | 0 | 5 | 43 | 68 |
| Picea abies | 0 | 36 | 82 | 97 | 0 | 15 | 71 | 92 |
La clave de las distintas clases de desarrollo (CD) puede encontrarse en la Figura 9.16.
El peróxido de hidrógeno (H2O2) tiene un efecto de estimulación de la germinación de las semillas, y se ha utilizado en la parte occidental de los Estados Unidos en un ensayo rápido de germinación de varias coníferas (Bonner 1974). Se dejan las semillas en remojo durante toda la noche en H2O2 al uno por ciento. Se corta después la cubierta seminal para dejar al descubierto el extremo de la radícula, y se vuelven a poner las semillas en H2O2 al uno por ciento, en un lugar oscuro, y con alternancia de temperaturas, (20°C y 30°C). A los tres o cuatro días se efectúa un recuento y se renueva el H2O2, y la evaluación final se efectúa a los siete u ocho días. Si la radícula tiene 5 mm o más, la germinación se considera “evidente”; cuando tiene entre 0 y 5 mm se considera “escasa”, y cuando no ha habido crecimiento alguno de la radícula se considera que la semilla es no viable o vacía (Danielson 1972, citado por Bonner 1974). El ensayo es más rápido pero menos fiable que un ensayo de germinación normal (en el que se suele obtener una germinación final más rápida y elevada), más lento pero más sencillo de realizar que el ensayo de excisión del embrión y más fácil de interpretar que el ensayo de tetrazolio.
9.17 Radiografía con rayos X de semillas de Pinus caribaea. Casi todas ellas tienen el gametófito y el embrión muy poco desarrollados, y están muertas. Las pocas que son germinables están contorneadas en negro. (M. Simak)
 | 9.18 Semillas de Quercus cortadas por la mitad para pasar a la estufa, a fin de determinar su contenido de humedad. (Servicio Forestal, Dpto. Agric. EE.UU.) |
