Los otolitos deben extraerse inmediatamente después de la muerte del pez, cuando esto no es posible los peces deben congelarse o fijarse debidamente para evitar la pérdida de las estructuras de crecimiento presentes en los otolitos. Las larvas y juveniles deben manipularse con mayor precaución, dado que la mayor proporción entre la superficie y el volumen de sus otolitos los hace más subceptibles a la degradación.
Al preservar los peces se produce cierta disminución del tamaño del cuerpo, lo que es especialmente importante en larvas y juveniles (Radtke, 1989; Kruse y Dalley, 1990). Los factores de corrección deben calcularse midiendo y pesando, antes y después de la preservación, una serie de ejemplares que cubran el rango de tallas a estudiar. La reducción del tamaño del cuerpo es proporcional a la talla del pez, función del tiempo de preservación y del preservante utilizado (Kruse y Dalley, 1990). En juveniles y larvas se debe, además, tener en cuenta el tiempo transcurrido entre la muerte y la fijación (Theilacker, 1980).
Dado que son cuerpos calcáreos, los otolitos son degradados por los fijadores ácidos como el formol. El formol tamponado puede variar de pH con el tiempo, por tanto su uso se limitará a períodos cortos. El fijador que ofrece mejores resultados es el etanol, que debe emplearse concentrado (85%) para compensar la dilución producida por el paso de los fluidos corporales al medio de preservación. El alcohol debe renovarse periódicamente para asegurar una mejor preservación. Añadir astillitas de marmol al fijador es una precaución que estabiliza el pH y asegura la preservación de los otolitos (Brothers, 1987).
La congelación es un buen método de preservación cuando no existe riesgo de descongelación parcial por variaciones de la temperatura, lo que causaría la pérdida de la calidad del otolito.
Al inicar el estudio de una especie debe tomarse nota de la posición y orientación in situ de los otolitos (asteriscus, lapillus, sagitta), de forma que su morfología y orientación relativa sean determinados por su posición en el sáculo ótico (fig. 1). El tamaño de un otolito puede cambiar a lo largo de la vida del pez, por tanto a pesar de ser la sagitta el mayor otolito en muchas especies, no debe diferenciarse únicamente por su tamaño.
El otolito empleado con mayor frecuencia es la sagitta, aunque en algunos estudios se ha utilizado el lapilli que es menor y requiere menos preparación (Brothers, 1987). Al determinar la edad debe emplearse siempre el mismo tipo de otolito, ya que el inicio de la formación de los incrementos no es simultáneo en los tres pares de otolitos.
Los dos otolitos de cada pez, derecho e izquierdo, deben recolectarse y mantenerse separados hasta que sea posible diferenciarlos por su morfología (Hecht, 1978). Los anillos de crecimiento suelen ser idénticos en ambos otolitos, por tanto cuando un otolito resulta dañado durante la manipulación o es cristalino, puede emplearse la pareja.
Al extraer los otolitos debe seccionarse el cráneo para acceder a las cámaras óticas. La morfología del cráneo es un carácter filogenético, por tanto la técnica de extracción debe modificarse según la especie a estudiar (Holden y Raitt, 1975). En peces redondos suele utilizarse un corte transversal en la cabeza, un poco detrás de los ojos. El corte debe ser lo suficiente profundo como para abrir el cráneo pero sin dañar los otolitos. Cuando el sáculo está expuesto se extraen los otolitos con ayuda de unas pinzas tomando la precaución de no romperlos. Si los otolitos son pequeños, es mejor extraer los canales semicirculares y separar los otolitos bajo la lupa binocular. Los otolitos pueden limpiarse de los tejidos adheridos frotándolos suavemente entre los dedos, o con la ayuda de las pinzas bajo la lupa. La inmersión en una solución al 5% de hipoclórito de sodio facilita la limpieza.
Los otolitos deben almacenarse de manera que se asegure su conservación e identificación y optimice el costo y el espacio de almacenamiento. Como los otolitos son cuerpos acelulares con una proporción pequeña de materia orgánica, el riesgo de descomposición es mínimo. Sin embargo, las estructuras de crecimiento son más visibles en los otolitos recien colectados. Por tanto, éstos deben leerse a la mayor brevedad posible.
Fig. 1. Aspecto general del laberinto auditivo derecho por la cara medial. am: ampulla, as: asteriscus, cs: canales semicirculares, l: lagena, lp: lapillus, ml: mácula lagenar, ms: mácula sacular, mu: mácula utricular, no: nervio octavo, pi: pars inferior, ps: pars superior, s: sáculo, sg: sagitta, u: utriculus.
Los otolitos pueden almacenarse en viales o tubos de prueba, en seco o con un líquido aclarante cuando se va a proceder a su lectura inmediata. Otro de los métodos empleados es adherirlos con barniz de uñas transparente en un portamuestras o con cinta adhesiva de dos caras a una lámina de acetato. Los otolitos poco frágiles suelen guardarse en seco dentro de sobres de papel con la debida referencia.
Las larvas pequeñas y transparentes pueden ser situadas en un medio de montaje clarificante de forma que los otolitos se observen directamente en su interior. El cubremuestras se presiona suavemente hasta romper el cráneo y exponer los otolitos liberándolos de los tejidos circundantes.
La extracción de los otolitos de larvas de mayor tamaño es relativamente fácil cuando las larvas son transparentes. Al observarlos bajo una lupa con luz polarizada, los otolitos aparecen como puntos lumuinosos contra un fondo obscuro. Las larvas se sitúan en una lámina portamuestras con una gota de agua y se extraen los otolitos con ayuda de agujas enmangadas finas.
Tras la extracción, los otolitos se dejan secar durante unos minutos y se sitúan con la cara distal hacia abajo cubriéndose con un medio de montaje neutro del tipo: Euparal, Flo-texx; Depex, Permount (1) que clarificará su estructura y finalmente se cubren con un cubremuestras. El medio de montaje se encoje al secarse, por lo que la presión del cubremuestras puede romper los otolitos. Para evitar esto, se coloca un trocito de hilo de pescar o de otro material neutro a cada lado del otolito con objeto de mantener una distancia constante entre el cubre y el portamuestras. La preparación resultante no debe ser muy gruesa ya que la distancia de trabajo del microscopio es pequeña a los aumentos necesarios para observar los incrementos. Cuando los otolitos se montan en medios del tipo Flo-texx (1), que al secarse son rígidos el cubremuestras puede eliminarse.
El aceite de inmersión y aceite mineral son medios de montaje que no solidifican y permiten el posterior manejo de los otolitos. Sin embargo, tras cierto tiempo en estos medios los otolitos pueden resultar ilegibles (Brothers, 1987). El borde del cubremuestras debe sellarse con barniz de uñas o cola y las láminas deben mantenerse horizontales y protejidas del polvo.
El bálsamo del Canadá es o puede tornarse ácido con el tiempo, por tanto no se debe utilizar para montar los delicados otolitos de las larvas.
