APENDICE 1

Metodologia analitica para la caracterización de la eclosión de los quistes de Artemia

PORCENTAJE DE ECLOSION - Método A

A.1.	Incubar, en un tubo cilindroconico (preferentemente), o en una probeta (ver dibujos esquematicos en la seccion sobre eficiencia de eclosion en este mismo apendice), 250 mg de quistes en unos 100 ml de agua de mar de 35‰ con iluminacion permanente (1000 lux) y a una temperatura de 25°C, instalar la aireacion desde el fondo para mantener los quistes en suspensión (la aireacón no debe ser demasiado fuerte para avitar la formación de espuma).
A.2.	Al cabo de una hora se tomarán, por medio de una micropipeta automatica (preferentemente) o de una pipeta de vidrio de o,5 ml a la que se le ha cortado la pubta (si la abertura as demasiado pequeña para permitir el paso de quistes/nauplios), 10 submuestras (i=10) de unos 100 quistes cada una.
A.3.	Pipetear los quistes de cada submuestra sobre papeles de filtro individuales
A.4.	Contar los quistes de cada papel de filtro usando una lupa de diseccion (Ci); calculando el valor medio (C)
A.5.	Lavar los quistes de los papeles de filtro en capsulas Petri de vidrio, individuales o en pequeños tubos de plastico (5 ml); añadir agua de mar de 35%. previamente aireada, e incubarlos a 25°C bajo iluminación continua (>1000 lux)
A.6.	Al cabo de 48 horas, fijar los nauplios añadiendo unas gotas de una solución de lugol. Modo de preparación de la solución de lugol:
	-	disolver 10 g de KI y 5 g de I2 en 20 ml de agua destilada
	-	disolver 5 g de acetato sódico en 50 ml de agua destilada
	-	mezclar las dos soluciones y conservarla en una botella oscura en el frigorífico
	La tintura de yodo usada en farmacia como desinfectante puede ser una alternativa para el lugol
A.7.	Contar los nauplios usando una lupa de diseccion (ni) y calcular el valor medio (n) Método práctico para el recuento de nauplios:
	-	construir un pequeño filtro con un tubo de PVC (8 cm de diámetro, 1–2 cm de altura) al que se pega una malla de nylon de 100 μm
	-	vaciar el contenido de la placa de Petri o del tubo de plástico sobre este filtro; lavar el contenido de las placas o de los tubos y verterlos sobre el filtro
	-	colocar el filtro en una placa de Petri llena de agua, agitar y mover el filtro dentro y fuera del agua, comprobando que se produce una buena distribución de los nauplios sobre la malla, lo que facilita su recuento.
	-	sacar el filtro de la placa Petri, secandolo por su parte inferior con una toalla o papel de filtro
	-	colocar el filtro bajo la lupa para el recuento; eventualmente, se puede poner el filtro en una placa de Petri que ha sido previamente marcada para facilitar el recuento
A.8.
A.9.	Ejemplo práctico

PORCENTAJE DE EDLOSION - Método B

B.1.	Igual que en A.1.
B.2.	Tras 48 horas de incubación tomar por medio de una micropipeta automática (preferentemente), o de una pipeta de vidrio de 0,5 ml a la que se le ha cortado la punta (si la abertura es demasiado pequeña para permitir el paso de los quistes/nauplios), 10 submuestras (i = 10) que contengan, aproximadamente, unos 100 nauplios y quistes sin eclosionar, cada una.
B.3.	Pipetear los quistes de cada submuestra en una placa de Petri y fijar los nauplios con unas gotas de una solución de lugol.
B.4.	Contar los nauplios (ni) con una lupa de disección (eventualmente aplicando el metodo descrito en el apartado A.7.). Calcular el valor medio (n).
B.5.	Decapsular los quistes no eclosionados y disolver las cáscaras de quistes vacios añadiendo una gota de una solucion de NaOH (40 g/100 ml/de agua destilada) y 5 gotas de una solución de lejía doméstica (5,25 % NaOCl). Cuando se aplique el método A.7., dentro del apartado B.4., entonces sumergir el filtro (s) con los nauplios y los quistes en una placa Petri llena con la solución decapsuladora (lejía doméstica pura + algunas gotas de NaOH). Tras algunos minutos sacar el filtro, lavar con agua dulce y continuar como en el apartado A.7.
B.6.	Contar los embriones no eclosionados (de color anaranjado) (ci) y calcular el valor medio (c).
B.7.
B.8.	Ejemplo práctico

EFICIENCIA DE ECLOSION (ver dibujos esquematicos)

1. Incubar en una probeta o en un tubo cilindrocónico (preferentemente), 250 mg de quistes en 80 ml de agua de mar de 35%. con iluminación continua (1000 lux) y a 25°C; instalar la aireación desde el fondo para mantener los quistes en suspensión (la aireación no debe ser excesivamente fuerte para evitar la formación de espuma). Hacer el ensayo por triplicado.

2. Tras 1 hora ajustar el volumen a 100 ml añadiendo, exactamente, 20 ml de agua de mar de 35%. y tomar, por medio de una micropieta automatica, 10 submuestras (i = 10) de 250 ul exactos, cada una. Comprobar que no se ha pipeteado ninguna burbuja de aire.

3. Depositar las submuestras pipeteadas en placas Petri o preferentemente en tubos plásticos (5ml).

4. Añadir agua de mar de 35%. previamente aireada (llenando el tubo de plastico solo en un 80%).

5. Cubrir las placas Petri; cerrar los tubos con sus tapones (asegurandose de dejar algo de aire bajo el tapon) y fijarlos al equipo rotatorio de eclosión (5 rpm).

6. Incubar bajo condiciones de iluminación continua (1000 lux) a 25°C.

7. Al cabo de 48 horas, fijar los nauplios con algunas gotas de una solución de lugol.

8. Contar los nauplios de cada tubo (ni), aplicando, eventualmente, la técnica descrita en el apartado A.4.. Calcular el valor medio n por tubo de eclosión y la media global para los tres tubos (N).

9. Eficiencia de eclosión = Número de nauplios por gramo de quistes = N × 4 × 100 × 4.

10. Ejemplo práctico

N = 156,7
Eficiencia de eclosión = 156,7 × 1600 = 250.800 nauplios por gramo de quistes (d.s. = 9,100)

PORCENTAJE DE ECLOSION

1. Incubar en una probeta o en un tubo cilindrocónico (preferentemente), 250 mg de quistes con 80 ml de agua de mar de 35%., bajo iluminación continua (1000 lux) y a 25°C; instalar la aireación desde el fondo para mantener los quistes en suspensión (la aireación no debe ser excesivamente fuerte para evitar la formación de espuma). Realizar el ensayo por triplicado.
2. Tras 1 hora, ajustar el volumen a 100 ml añadiendo, exacta mente, 20 ml de agua de mar de 35‰. Señalar con una marca el volumen de 100 ml.
3. Al cabo de, aproximadamente, 12 horas añadir agua de mar para ajustar el volumen (llevándolo hasta la marca de referencia), compensando las pérdidas por evaporación. Tomar por medio de una micropipeta automática, a intervalos de una hora, 4 submuestras de 250 μm exactos, cada una.
4. Pipetear las submuestras en placas Petri, fijar los nauplios con unas gotas de la solución de lugol y contar los nauplios (ver apartado A.7.). Calcular el valor medio por tubo de eclosión y la media total para los duplicados.
5. Continuar con el muestreo/recuento hasta que el valor medio de nauplios permanezca constante, durante 3 horas consecutivas; ajustar el nivel de agua en los tubos de eclosión cada 3 horas.
6. Los valores medios totales de las muestras tomadas cada hora, se expresarán como porcentaje de la eficiencia de eclosión máxima, representandolos en una curva de tasa de eclosión. Los valores de T₄₀, T₅₀, T₉₀ y T_s pueden ser extrapolados desde la gráfica.
7. Ejemplo práctico (ver tambien la gráfica)